微卫星DNAPCR扩增结果示例精编版

1、NTMCGenetics基因诊断的概念 直接在DNA或RNA水平上进行结构与功能检测，从而辅助临床进行的诊断。 基因诊断是近年来临床医学中发展十分迅速的一类崭新的诊断技术，它依托DNA重组技术，从基因型入手，诊断表现型。（逆向诊断） 基因诊断始于1978年，Kan第一次成功进行了镰状细胞贫血病的产前基因诊断。 基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低，并对许多疾病特别是遗传性疾病具有预测性的特点，是一种极具潜力的诊断方法。NTMCGenetics 由于基因诊断的发展时间还不长，人类对基因的了解还有许多空白，因此许多疾病的诊断还主要依赖于传统的方法，但随着分子遗传学、分子生物学，特别是人类基因组计

2、划的完成，基因诊断将显示出强大的生命力。NTMCGenetics传统的诊断（举例）：传统的诊断（举例）：、问、望、听、触经验型诊断、化验/检验材料：细胞、组织、大分子、小分子、代谢/排泄物等。方法：细胞学、微生物学、生物化学、免疫学、病理学等。、影像学X光、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。、特殊检查染色体检查、肌电/心电/脑电、骨密度等。 在医学发展的过程中，这些方法发挥了巨大作用，随着技术水平的发展，这些方法也在不断提高和完善，也还会有其他新的诊断方法的问世。这些诊断有一个无法逾越的鸿沟：预测也就是说“发病”了才能诊断。NTMCGenetics基因诊断的对象基因诊断的对象1、病原生物的侵入，

3、如流感、肝炎、艾滋病2、单基因遗传性疾病， 如苯丙酮尿症、无丙种球蛋白血症3、多基因疾病，如肿瘤、高血压 4、其它，如亲子鉴定、个体识别、法医物证NTMCGenetics遗传标记遗传标记1、第一代遗传标记限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)8kb5kb3kb在个体和群体中，片段长度表现出多态性。如3kb, 5kb, 7kb, 8kbRFLP呈现孟德尔式遗传。常用检查方法：核酸杂交；PCR-酶切等。NTMCGenetics产生多态性的原因是内切酶位点的变化。原位点的消失；新位点的产生。GAATTCCTTAAGGA

4、TTTCCTAAAG1 21 21 2III2kb3kb5kb7kbNTMCGenetics2、第二代遗传标记微卫星DNA(Micro-satellite DNA) 属高度重复序列，重复单元26bp，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG常用检查方法：PCR等。NTMCGenetics微卫星微卫星DNA PCRDNA PCR扩增结果（示例）：扩增结果（示

5、例）：500bp400bp300bp240bp 该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。 微卫星DNA差异最小只相差2个碱基（重复片段只有2个碱基）。NTMCGenetics2、第三代遗传标记单核苷酸多态性(SNP) 某些DNA位点上，单个碱基存在着变化。如：AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT个体A个体B个体C SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。在人类DNA序列变异中

6、，SNP占90%。 单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。目前已知基因组中含有150万个NTMCGenetics对于人类来说，SNP的意义在于：、致病SNP、疾病易感性SNP、具有诊断价值的SNP、疾病的SNP谱、人表型相关SNP、药物作用与不良反应的SNP、药物剂量SNP目前SNP研究的两个热点：、cDNA上的SNP（cSNP）、启动子上的SNPNTMCGenetics芯片杂交结果示意图A C G T位点1位点2位点3常用检查方法：DNA测序、芯片杂交等。NTMCGenetics基因变异的类型基因变异的类型1、点突变）单个碱基置换）单个碱基的缺失或插入2、片段缺失编码片段；调节序列3、片段插入

7、编码片段；调节序列4、重排融合基因5、扩增拷贝大量增加6、动态突变遗传物质传递过程中不等交换使STR重复数增加NTMCGenetics基因诊断的技术方法基因诊断的技术方法Southern 杂交NTMCGeneticsNorthern 杂交NTMCGeneticsWestern印迹中蛋白电泳NTMCGeneticsPCR原理NTMCGeneticsPCR原理变性NTMCGeneticsPCR原理复性NTMCGeneticsPCR原理延伸NTMCGeneticsPCR原理变性NTMCGeneticsPCR原理复性NTMCGeneticsPCR原理延伸NTMCGeneticsPCR原理变性NTMCG

8、eneticsPCR原理复性NTMCGeneticsPCR原理延伸NTMCGenetics DNA DNA以指数形式扩增以指数形式扩增(2(2n n) )，其中长片段以线性形式扩增其中长片段以线性形式扩增 (2(2n+2)n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。最终主产物片段长度在两个引物之间。预变性(92-95C,2-5m)变性(92-95C,30s)复性(40-60C,30s)延伸(72C,30-60s)总延伸(72C,7m)(25-35)PCRPCR的一般过程：的一般过程：经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。2401625611452228200短片段（单链）14

9、12108642长片段（单链）128643216总片段（单链）循环数NTMCGenetics等位基因特异性寡核苷酸杂交（allele-specific oligonucleotide，ASO ） 当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定

10、杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来. PCR可结合ASO，即PCRASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。NTMCGenetics异常探针 T A G正常人 患者 DNA DNA点杂交正常探针 G A G正常人 患者 DNA DNA点杂交NTMCGenetics单链构象多态性单链构象多态性PCR (SSCP-PCR)PCR (SSCP-PCR)DNA分子在电泳中的行为取决于分子量和分子构象。DNA单链的构象取决于序列。PCR产物变形后于中性胶中电泳，与正常对照

11、比较，若电泳行为异常，则认为内含突变的碱基。NTMCGenetics对照对照 实验实验NTMCGenetics等位基因特异性等位基因特异性PCR(Allele-PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)Specific PCR, AS-PCR)利用末端突变的引物进行PCR。实际应用中，常使用三个引物：A35G3553正常上游引物正常下游引物突变上游引物使用正常引物，在正常人有扩增，异常人无扩增。使用突变引物，在异常人有扩增，正常人无扩增。（严格条件下的PCR）NTMCGeneticsO碱基碱基CPOHH12345O碱基碱基CPOHH12345OH脱氧核苷酸的连接脱氧核苷酸

12、的连接DNADNA测序测序NTMCGeneticsO碱基碱基CPOH12345O碱基碱基CPOHH12345H2O脱氧核苷酸的连接脱氧核苷酸的连接NTMCGeneticsO碱基碱基CPHH12345O碱基碱基CPOHH12345OHX双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸?NTMCGenetics四套反应体系四套反应体系1-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP2-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP3-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTP4-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTPATGCGGTACCAT53

13、测序模板5 TA5TACGCCA5TACGCCATGGTACCC第一套反应第二套反应555NTMCGeneticsACGTATGGTACCGCATNTMCGeneticsDNA自动测序NTMCGenetics荧光原位杂交荧光原位杂交( (Fluorescence in Fluorescence in situ Hybridization,FISH)situ Hybridization,FISH) 利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针，并通过荧光素偶联得抗原-抗体检测系统，在组织、细胞及染色体上对DNA或RNA进行定性或定位分析。标记物：脱氧尿嘧啶三磷酸Bio-11-dUTP(生物素) Di

14、g-11-dUTP(地高辛)标记方法：缺口平移法，随机引物法。NTMCGenetics荧光标记原位杂交原理示意图NTMCGenetics染色体FISH探针整条染色体涂染探针染色体重复序列探针染色体专一位点探针基本过程：1、染色体标本制备2、探针制备3、杂交4、显微观察（染色体分带）NTMCGenetics整条染色体涂染NTMCGenetics通过整条染色体涂染判断易位染色体NTMCGenetics染色体重复序列探针NTMCGenetics染色体专一位点探针NTMCGenetics荧光标记探针检测精子NTMCGenetics引物原位标记技术引物原位标记技术( (Primed in situ Pr

15、imed in situ Labeling, PRINS)Labeling, PRINS) 针对染色体的特异性-卫星DNA 序列设计和合成引物。 利用未标记的寡核苷酸引物与变性后的染色体DNA特异结合, 然后用荧光素标记的脱氧核苷酸(dUTP)与未标记的脱氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应,标记了的dUTP将以碱基配对的形式掺入到新合成的DNA单链中, 最后用相应的荧光抗体与标记物结合以显示检测结果。 NTMCGenetics应用21号染色体特异性卫星DNA与间期细胞核杂交，显示21号染色体的数目。NTMCGenetics基因诊断实例基因诊断实例丙型肝炎丙型肝炎(HCV)(HCV)

16、基因诊断实例基因诊断实例丙型肝炎为RNA病毒，9500mer，编码3011-3033个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：E1NS2NS3NS43-NCRCNS1/E2NS15-NCR高变异区（编码衣壳和包膜蛋白）（NCR: 非编码区） 5-NCR为保守的区域，将引物设计在该区域，进行RT-PCR, 可特异性的扩增HCV。PCR引物：+: 5-GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT-: 5-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCTPCR产物长度为322bpNTMCGeneticsNTMCGeneticsNTMCGeneticsNTMCGeneticsDXS5

17、2DXS52位点多态性诊断甲型血友病位点多态性诊断甲型血友病 DXS52位点的微卫星DNA与Xq28位点紧密连锁，甲型血友病的基因位点也在此区域，因此可以通过DXS52间接诊断血友病。 DXS52在群体中的类型： 0.7，1.3，1.39，1.57，1.63，1.69，2.1，2.4kb。引物序列：5-GGCATGCATCACTTCTCTCATGTT5-CACCACTGCCCTCACGTCACTTNTMCGenetics家系INTMCGenetics家系IINTMCGenetics家系IIINTMCGeneticsRFLP法诊断苯丙酮尿症NTMCGeneticsNTMCGenetics母体外周血胎儿细胞的富集 1893年发现母体中含有胎儿细胞，1964年发现孕妇外周血中含有未成熟的胎儿红细胞。1969年在22个孕有男胎的孕妇外周血中,19例发现46,XY细胞。因此从孕妇外周血中分离胎儿细胞进行产前诊断成为可能，并随着技术进步，正向着实用性发展，成为非损伤性产前