高速逆流色谱溶剂体系筛选方

1、 高速逆流色谱溶剂体系筛选方法高速逆流色谱溶剂体系筛选方法 晋晓峰晋晓峰 研发部副主管研发部副主管上海同田生物技术有限公司上海同田生物技术有限公司HSCCC分离条件分离条件分离分离效果效果溶剂条件转速流速温度样品基本原则基本原则: : 不造成样品分解或变性不造成样品分解或变性 对样品有较大溶解度对样品有较大溶解度 固定相在分离柱中有较好保留固定相在分离柱中有较好保留 样品在两相溶剂系统中有合适的分配系数样品在两相溶剂系统中有合适的分配系数溶剂体系的筛选方法溶剂体系的筛选方法1. 分配系数（分配系数（ K ）法）法 K Cs/Cm Cs为溶质在固定相中的质量浓度为溶质在固定相中的质量浓度 Cm为

2、溶质在流动相中的质量浓度为溶质在流动相中的质量浓度 Cs和和Cm的比值可通过的比值可通过HPLC测得测得 理想的分配比值理想的分配比值 k = 0.52，允许，允许0.25CsCm两种溶质分离因子：两种溶质分离因子： K1/K2（1.5）当当Cs / Cm 0.5时，出峰时间太快，分离度较差时，出峰时间太快，分离度较差当当Cs / Cm 2时，出峰时间太长，且峰形变宽时，出峰时间太长，且峰形变宽 芦荟提取物的芦荟提取物的HPLC图谱图谱-20.00164.00348.00532.00716.00900.000.002.505.007.5010.0012.5015.0017.5020.0022.

3、5025.00mAUmin实例（实例（HPLC法测法测K值）值）芦荟未知物芦荟未知物芦荟苷芦荟苷B芦荟苷芦荟苷A 上层 下层体系体系氯仿氯仿/ /异丁醇异丁醇/ /甲醇甲醇/ /水（水（4/0.25/3/2） 目标物质目标物质芦荟未知物芦荟未知物芦荟苷芦荟苷A芦荟苷芦荟苷B分配系数分配系数K0.91.92.3HSCCC保留时间保留时间2.3 h4.0 h5.3 h芦荟未知物芦荟未知物芦荟苷芦荟苷B芦荟苷芦荟苷A-10.00072.000154.000236.000318.000400.0000.0040.0080.00120.00160.00 200.00240.00 280.00320.00

4、 360.00400.00mvmin芦荟提取物的芦荟提取物的HSCCC图谱图谱芦荟苷芦荟苷B芦荟苷芦荟苷A芦荟未知物芦荟未知物 对已知化合物类别的物质可参考相关文献，在文献提供对已知化合物类别的物质可参考相关文献，在文献提供的体系的基础上进行调整的体系的基础上进行调整 对未知样品对未知样品，可采用氯仿可采用氯仿-甲醇甲醇-水水=10-3-7或正己烷或正己烷-乙乙酸乙酯酸乙酯-甲醇甲醇-水水=1-1-1-1两个极性分布范围较广的体系两个极性分布范围较广的体系先进行尝试先进行尝试，也可以根据样品的极性选择相对应的溶剂，也可以根据样品的极性选择相对应的溶剂体系，体系，再根据目标组分的分配系数进行调整

5、再根据目标组分的分配系数进行调整2. 经验法经验法溶剂体系根据极性可以分为三类：溶剂体系根据极性可以分为三类： 疏水性（石油醚体系，正已烷体系）疏水性（石油醚体系，正已烷体系） 中等疏水性（氯仿体系，甲基叔丁基醚体系）中等疏水性（氯仿体系，甲基叔丁基醚体系） 亲水性（正丁醇体系，乙酸乙酯体系）亲水性（正丁醇体系，乙酸乙酯体系） 3. 分析型分析型HSCCC法法 优点：优点： 分析时间短分析时间短 溶剂消耗少溶剂消耗少 进样量小，节省样品进样量小，节省样品 确定的体系可直接用于确定的体系可直接用于 放大制备，重现性佳放大制备，重现性佳仪器：仪器：TBE-20A 转速：转速：1600r/min 流

6、速：流速：0.5ml/min样品：样品：8沙棘提取物沙棘提取物体系：正己烷体系：正己烷/ /乙酸乙酯乙酸乙酯/ /乙醇乙醇/ /水水 洗脱方式：下相作为流动相洗脱方式：下相作为流动相实例（分析型实例（分析型HSCCC法）法）1：1：1.2：0.81：1.2：1.2：0.80.8：1.2：1.2：1.20.8：1.2：1.2：1.5正己烷正己烷/ /乙酸乙酯乙酸乙酯/ /乙醇乙醇/ /水水（0.8：1.2：1.2：1.7）槲皮素槲皮素山萘酚山萘酚异鼠李素异鼠李素HSCCCHSCCC工艺重现性工艺重现性-5.00066.000137.000208.000279.000350.0000.0025.0

7、050.0075.00100.00 125.00150.00 175.00200.00 225.00250.00mvmin-5.00066.000137.000208.000279.000350.0000.0028.0056.0084.00112.00 140.00168.00 196.00224.00 252.00280.00mvminTBE-20A TBE-20A 分析型分析型HSCCCHSCCCTBE-300B TBE-300B 半制备型半制备型HSCCCHSCCCTBE-1000A TBE-1000A 制备型制备型HSCCCHSCCC4.4.多元溶剂体系的选择方法多元溶剂体系的选择方法

8、ItoIto方法方法HBAWHBAW方法方法ARIZONAARIZONA方法方法 Ito认为溶剂体系的筛选可以从氯仿认为溶剂体系的筛选可以从氯仿- -甲醇甲醇- -水水(2:1:1)(2:1:1)开始，如开始，如果分配系数落在果分配系数落在0.2-5的范围内，通过调整可以获得满意的分配系数的范围内，通过调整可以获得满意的分配系数。如果样品主要分布在非水相的下相中时，应尝试下表中箭头向上。如果样品主要分布在非水相的下相中时，应尝试下表中箭头向上的体系，如果样品主要分布在上相时，则应试验相反方向的体系。的体系，如果样品主要分布在上相时，则应试验相反方向的体系。 BHAWBHAW方法是将非极性溶剂体

9、系正已烷方法是将非极性溶剂体系正已烷- -乙腈（乙腈（1:11:1）和极性溶剂体）和极性溶剂体系正丁醇系正丁醇- -水（水（1:11:1）结合起来，形成了）结合起来，形成了7 7种多元溶剂体系，编号种多元溶剂体系，编号为为-3-3+3+3 首先试验首先试验0 0号溶剂体系，以确定下一步试验的方向。如果样品倾号溶剂体系，以确定下一步试验的方向。如果样品倾向于极性的水相，应该进一步实验向于极性的水相，应该进一步实验0 0+3+3号正方向的体系，否则号正方向的体系，否则应该试验应该试验0 0-3-3号反方向的体系号反方向的体系 这组溶剂的特点是紫外透明性很好这组溶剂的特点是紫外透明性很好 ARIZO

10、NAARIZONA方法是结合乙酸乙酯方法是结合乙酸乙酯- -水体系（水体系（1 1：1 1，体系，体系A A，极性）和，极性）和正庚烷正庚烷- -甲醇体系（甲醇体系（1 1：1 1，体系，体系Z Z，非极性）定义了，非极性）定义了2323种整个溶剂种整个溶剂范围内的溶剂体系，并用范围内的溶剂体系，并用A AZ Z的的2323个字母（个字母（E E，I I，O O除外）表示除外）表示 操作时只需做两个实验，将样品分别溶解在体系操作时只需做两个实验，将样品分别溶解在体系A A和体系和体系Z Z中，如中，如果绝大部分样品集中在体系果绝大部分样品集中在体系A A的乙酸乙酯相和体系的乙酸乙酯相和体系Z Z的甲醇相，那的甲醇相，那就有可能在体系就有可能在体系A AZ Z中找到一个合适的体系中找到一个合适的体系 总结：总结： 溶剂体系的选择是溶剂体系的选择是HSCCC分离中最关键也是难度最分离中最关键也是难度最大的一个环节，一般大的一个环节，一般从样品的溶解度从样品的溶解度，通过参