省中医局申请书上2008

1、湖南省中医药科研计划项目申请书上册（任务书）课 题 名 称：针刺抑制血管再狭窄细胞外基质的机制研究 承 担 单 位： 湖南中医药大学 课题负责人： 雷 磊 联系地址和电话：长沙市含浦科教园区象嘴路题申请时间： 2008年4月 湖南省中医药管理局一、基本情况研究课题名称针刺抑制血管再狭窄细胞外基质的机制研究所属学科针灸推拿学研究工作总经费10万研究工作起止年月2009年1月至2011年12月预期成果发表核心期刊论文23篇，通过结题报告课题组主要成员序号姓 名身份证号职称学历所在单位课题中分工签名1雷 授博研湖南中医药大学全面负

2、责2吴亦主任医本科湖南中医药大学临床研究3王净净430103540312207教 授本科湖南中医药大学临床研究4孟 师硕研湖南中医药大学指标检测5朱 伟522121741121142讲 师硕研湖南中医药大学指标检测6李慧 员本科湖南中医药大学资料管理7孟延治医师本科湖南中医药大学临床研究8马本 教本科湖南中医药大学统计分析9承担单位序号单位名称地址及联系电话1湖南中医药大学长沙市含浦科教园区象嘴

3、路 0731-845807223二、研究目标通过对再狭窄中细胞外基质合成的新的病理规律的研究，探讨针刺抑制平滑肌细胞和成纤维细胞合成细胞外基质的作用靶点和细胞分子生物学机制。为防治再狭窄提供新的治法。三、主要研究内容和技术方案摘要基于前期研究结果：针刺可调节大鼠颈动脉再狭窄模型血清中生物活性物质的平衡及影响家兔髂动脉再狭窄模型血管细胞凋亡，从而阻抑动脉再狭窄的病理进程。本研究针对细胞外基质(ECM)的主要病理环节，以小型猪颈动脉再狭窄模型及冠状动脉成形术后再狭窄患者为受试对象；以针刺方法为被试因素；采用免疫组化、原位杂交和逆转录聚合酶链反应等方法。从动物实验和临床观察相结合的角度研究血管成形术

4、后不同阶段血管外膜成纤维细胞在内膜和外膜增生、分泌胶原参与再狭窄的规律；探讨再狭窄早期血管基膜成分的降解，促进中膜平滑肌细胞和外膜成纤维细胞向内膜迁移的规律；以及研究针刺抑制细胞外基质的作用靶点和细胞分子生物学机制。为防治再狭窄提供针刺新治法，也为防治动脉粥样硬化等相关疾病提供新的防治思路和方法。关键词经皮冠状动脉成形术；再狭窄； 细胞外基质；针刺；猪研究内容制作小型猪颈动脉再狭窄的动物模型和选择PTCA后再狭窄患者，针刺干预，研究球囊扩张后再狭窄形成过程中：1.血管基膜成分的降解对平滑肌细胞和成纤维细胞的迁移作用2.平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖作用3.损伤血管内膜增殖和血管重塑的规律4.针刺

5、对上述病理环节的干预作用。研究方案1.动物实验参照文献毕建忠,来超,谢召宏,等小型猪颈动脉粥样硬化性狭窄模型的建立.山东大学学报:医学版.2005,43(6).504-507的方法，采用过大球囊扩张小型猪一侧颈总动脉后高脂饲养3个月的造模方法以病理组织形态学分析为主，B 型超声检查为辅的血管狭窄分析方法。建立小型猪颈动脉粥样硬化性狭窄模型。1.1 研究对象：1.1.1 动物：中国小型猪(II型)24头，雌雄不拘，5月龄，体重15 kg，购自中国农业大学试验用小型猪繁育场或中科院。动物编号后单圈饲养，保持圈内温度在1823之间，基本按800g/d猪给予饲料，保证每日热量供给不低于2400 Kca

6、l，饮水不受限制。全部动物先以普通饲料喂养半月，然后按体重进行分层随机分为4组，每组6只。分别为：空白对照组、模型组、针刺组和药物对照组，后3组制作颈动脉粥样硬化性狭窄模型。1.1.2 饲料：基础饲料(玉米64.0%、豆饼14.5% 、麸皮12.0% 、鱼粉5.0%、骨粉2.0%、预棍料2.0% 、食盐0.5 %) ；高脂饲料(基础饲料49.0%、蛋黄粉20.0%、猪油15.0%、花生油15.0%、食盐1.0%)。1.1.3试剂与仪器：氯胺酮、复方泛影葡胺、71705全自动生化分析仪购自日本日立公司；6 000一维彩色多普勒超声机购自日本东芝公司；Angiostar Plus血管造影机购自德国

7、西门子公司；40 mm6 mm球囊扩张导管购自法国Balt公司。1.2 研究方法1.2.1 颈动脉粥样硬化性狭窄模型制作：手术切开暴露右侧股动脉，穿线后提起。用18 G穿刺针直视下穿刺股动脉，导入造影导管，送入一侧颈总动脉起始端，快速推入75%泛影葡胺1520 ml造影；同样对另一侧行造影检查，证实无血管变异。交换入6 mm球囊导管至右侧颈总动脉中段，给球囊充气至608 891kPa，持续30 s, 间隔60 s ,重复3次后，保留球囊内压力101304 kPa来回拖拉球囊5次。退出球囊导管，造影证实扩张成功后退出导管。术后喂养高脂饲料90天，饲料每两周按体重加量。1.2.2 给药及针灸再狭窄

8、组(24只)，分组模型组、实验组、药物对照组。药物组普罗布考承德市普宁制药厂生产，用0.5%羧甲基纤维素钠配制成混悬液，按人临床剂量500mg/d折合成猪剂量为250mg/kg崔中林,张彦明.现代实用动物疾病防治大全.北京:中国农业出版社2001:788灌胃，自动脉再狭窄模型制作前2日至术后90日，连续灌胃92日。针刺组用针刺法，以小型猪穴位局部出现电针频率一致的轻微颤动为宜，针刺内关（双侧），厥阴俞（双侧），心俞（双侧），膻中，足三里(双侧)，取穴参照于船,现代中兽医大全.南宁:广西科学技术出版社,2000:363。每日1次，每次20分钟，疏波4HZ，密波20HZ，脉冲宽度0.5mm，输出电

9、压2030v。自动脉再狭窄模型制作前2日至术后90日，连续针刺92日。每针7日，体息3日。1.2.3 超声测量方法在二维条件下观察动脉有无斑块形成，斑块的大小、形态、回声强度等。局部放大测量膜厚、管腔内径。彩色多普勒测量收缩期峰速、舒张期峰速、搏动指数、阻力指数、血流量、心率，摄片保存。对B 超检查者施以同一人单盲措施。B 超检查时间为球囊扩张术前和扩张术后90 天，前者作为分组的依据，后者作为疗效的评价。1.3 病理取材动物处死后分别用生理盐水及10%中性福尔马林在生理状态下(100)冲洗及灌注颈动脉，取材后置于10%中性福尔马林中继续固定以保证血管的生理形态，之后选取扩张段血管0.51.0

10、cm石蜡包埋，均匀间断切片510张，切片厚度5，分别作HE染色及原位杂交。1.4 指标测定：指标设计，实验注重疗效、注重平滑肌细胞和成纤维细胞以及基质在血管内、中、外膜的位置。测定指标主要包括以下几方面：1.4.1 基膜降解和细胞迁移指标：取球囊扩张7日后，模型组局部血管测定型胶原蛋白含量检测：采用原位杂交的方法，具体方法参见武汉博士德生物工程有限公司试剂盒。图象分析结果。MMP2、MMP9和TIMP2的含量检测：采用原位杂交的方法，具体方法参见武汉博士德生物工程有限公司试剂盒。图象分析结果。平滑肌细胞和成纤维细胞数量检测：血管平滑肌肌动蛋白（-SM actin）免疫组化检测平滑肌细胞；免疫荧

11、光染色或波形蛋白免疫组化染色检测成纤维细胞（根据预实验选择其一）。 图象分析结果。1.4.2 增殖指标：取球囊扩张90 日后，各组动物局部血管测定：平滑肌细胞和成纤维细胞在损伤血管的内膜、中膜和外膜的含量，并观察细胞增殖的位置和种类。平滑肌细胞和纤维细胞细胞数量检测：方法同前。1.4.3 胶原的含量和来源：取球囊扩张7 日后模型动物和90 日后各组动物的局部血管，测定细胞外基质（主要为、型胶原）的沉积量和沉积部位。、型胶原蛋白检测：免疫组化染色，采用LSAB 法，DAB 显色。试剂盒及单克隆抗体均为DAKO 公司产品。图象分析结果。1.4.4 动物病理切片测定，损伤血管内膜增生和血管重塑指标取

12、球囊扩张7日后模型动物和90日后各组动物的损伤局部血管，病理切片，HE、弹力+VG染色，每支动脉分别选择3个增生最明显的视野，用SPOT-数码成像系统和Meta Morph图像分析系统测定：狭窄率( (内弹力板围绕面积残腔面积)/内弹力板内侧面积100%)、内膜增生面积(内弹力板围绕面积残腔面积)、组织学内径(残腔周长/)，内、中膜厚( (外弹力板周长/-残腔周长/)/2)；血管重塑指标：血管总的横截面积(外弹力膜围绕面积)、内弹力膜围绕面积、血管周长（外弹力膜周长）、血管腔周长、管腔面积和血管重塑指数(造模侧动脉外弹力膜面积/对照侧动脉外弹力膜面积)，每个视野测量3次，取平均值。1.5 统计

13、学分析：全部数据使用SPSS14.0软件处理。计量资料方差齐者，采用单因素方差分析和两两比较采用q检验，方差不齐者采用成组资料的秩和检验计数资料采用采用X2检验或成组四样本秩和检验（Kruskal-Wallis法）。2.临床试验2.1 病例纳入标准：参照1979年WTO缺血性心脏病命名及诊断标准国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题组.缺血性心脏病命名及诊断标准J.国际心血管杂志,1979 叶任高.内科学M.第6版1北京:人民卫生出版社,20041272273，年龄4075岁，有心绞痛症状和(或)心肌缺血的客观证据，行PTCA成功半年以内的冠心病患者60例。2.2病例选择标准

14、：2.2.1 纳入病例标准：超声诊断颈动脉内中膜厚度(IMT)1.0mm，有软斑块或混合性斑块者；能坚持针灸或服药12周，具备临床随访条件；年龄70岁；2.2.2 排除病例标准：颈动脉超声显示为硬斑块或管腔内斑块严重导致血流阻塞者；颈动脉IMT70岁者；正在使用调脂药物或参加其它临床试验者。2.2.3 病例排除标准：胰岛素依赖性糖尿病、未控制的严重高血压、肝肾功能严重损害、严重心功能不全及参加其他研究者。2.2.4 病例随机机方案及试验场所：选择符合要求的患者60例，分为治疗组30例，阳性对照组30例。采用完全随机分组法，先取85%的患者按住院日期与住院号码最后二位数字相加，再取其和的最后二位

15、查Dolls临床病例随机表；凡十位数与个位数相交为T者安排在实验组，为C者安排在对照组。再将15%的患者按照性别、年龄、病程及病变程度进行均衡性调整，减少不平衡性指数，使差异无显著意义(P0.05)，具有可比性。所有患者选自湖南中医药大学第一附属医院心脏介入中心。2.3 PTCA方法：材料与器械：经皮冠状动脉介入诊断(CAG)应用X线数字造影仪(美国OMIGA2 1 000 mA)，复查采取与首次介入治疗时相同的角度，所用球囊与支架为深圳业聚公司产品。冠脉内支架植入：所有患者选择性CAG术前3天均用阿司匹林300 mg/d，氯吡格雷75 mg/d，服用辛伐他汀20 mg/d；术中即刻动脉内肝素

16、3 000 IU，PCI术前加用7 000 IU，每延长1 h追加1 000 IU。介入方法：经股动脉穿刺，按常规PTCA方法插入指引导管、导丝及普通支架植入。冠脉内支架植入成功的标准：支架植入时充分打开，残余狭窄20%，血流达到TIMI 3级。冠脉内支架植入术后再狭窄的标准Dietz U,Rupprecht HJ,Ekinci O,et al.Angiographic analysis of immedi2ate and longterm results of PTCR vs.PTCA in complex lesions(COBARStudy)J.Catheter Cardiovasc I

17、nterv,2001,53(3):3592367. 介入治疗成功的血管在随访中CAG显示支架内或支架边缘5 mm以内血管直径狭窄率50%；随访时管腔内径丢失术后管腔内径净获得的50%。2.4 治疗方法：2.4.1 针刺组：用针刺法，以患者穴位局部出现电针频率一致的轻微颤动为宜，针刺内关（双侧），厥阴俞（双侧），心俞（双侧），膻中，足三里(双侧)，每日1次，每次20分钟，疏波4HZ，密波20HZ，脉冲宽度0.5mm，输出电压2030v。自术前2天至术后3个月，每针7日，体息3日。2.4.2 对照组30例给予普罗布考(承德制药厂生产) 500mg/d。疗程为自术前2 日至术后3个月。治疗期间，停服

18、一切活血化瘀中药、血管紧张素转换酶抑制剂及降血脂药物。参加研究的患者均签署知情同意书，对照组每月门诊复查时，通过患者提供的服用完的药瓶监测患者服药的依从性。2.5 观察指标2.5.1 症状改善情况：中医认为再狭窄(RS)仍属于胸痹的范畴。患者主要表现心悸、气短、胸闷、心前区疼痛、阵发性加重、舌质暗有瘀点瘀斑、脉细涩等，根据患者临床表现不同程度，在服药前后分别计算患者的症积分。2.5.2 症状等级划分标准：参照中医心病诊断疗效标准与用药规范中心肌梗死的症状分级标准：主动说出的症状记4分；如症状显著或持续出现记3分；症状重而间断出现记2分；症状轻或偶尔出现记1分；无症状记0分。2.5.3 心电图改

19、善情况：在患者服药前后分别做心电图检查，用药每2个月做1次心电图，并统计用药前后心电图ST-T段变化。2.5.4 心绞痛发生率：接受PTCA的病人的再狭窄多在术后6个月内发生，分别统计患者在此期间内发作心绞痛的症状轻重和人数以及发生再狭窄的人数。2.5.5 MMP2、MMP9和TIMP2的含量检测：空腹12h，晨起抽静脉血3ml，使用加入EDTA的试管，立即低温(4)离心(1000xg，10min)后取上清液，标本放于-20保存待测。采用原位杂交的方法，具体方法参见武汉博士德生物工程有限公司试剂盒。图象分析结果。2.5.6 疗效评定标准：临床症状参照中医心病诊断疗效标准与用药规范中心肌梗死的疗

20、效评价标准进行评定。显效：治疗后证候消失或积分值下降超过70%；有效：治疗后积分值下降在50%70%之间；无效：治疗后积分值下降不及50%；加重：治疗后积分值上升。心电图根据患者服药前后心电图ST-T段变化显示心肌缺血改善(ST-T段抬高0.05mv)的人数，计算心肌缺血改善的有效率。2.6 统计方法全部数据使用SPSS14.0软件处理。计量资料方差齐者，采用单因素方差分析和两两比较采用q检验，方差不齐者采用成组资料的秩和检验计数资料采用采用X2检验或成组四样本秩和检验（Kruskal-Wallis法）。技术路线1. 动物实验球囊扩张后天，模型组取材3只动物（剩余3只），测定损伤局部血管的迁移

21、指标、平滑肌细胞和成纤维细胞在内膜数量、型胶原的沉积量建立颈动脉损伤后血管再狭窄猪动物模型（18只）PTCA术后，喂高脂饮料（胆固醇、蛋黄粉、猪油）3个月周。球囊扩张后90 天，B 型超声测定内、中膜厚厚度，斑块大小，血流动力学指标；测定损伤局部血管的平滑肌细胞和成纤维细胞在内膜数量；、型胶原的沉积量；内膜增殖和血管重塑相关指标。针刺内关（双）、厥阴俞（双）、心俞（双）、膻中、足三里（双）普罗布考按250mg/d体重灌胃结果分析，判断针刺干预作用小型猪24只空白对照组（6只），基本饲料喂养3个月。药物对照组针刺组模型组超声评价均匀分组2.临床研究球囊扩张后90 天，观察症状改善情况、心电图改善

22、情况、心绞痛发生率、MMP2、MMP9和TIMP2的含量相关指标。针刺内关（双）、厥阴俞（双）、心俞（双）、膻中、足三里（双）普罗布考按500mg/d 口服治疗时间为自术后前2天至术后3个月，进行干预药物对照组针刺组结果分析，判断针刺干预作用PTCA患者60例完全随机分组法四、实施计划和考核指标工作起止年月研究内容考核指标经费预算（万元）2009.12009.3购买试验所需添置仪器设备、药物试剂，确定正式实验计划方案与步骤研究所需药物试剂齐备、试验设计方案完成。1.52009.42009.6完成动脉模型的复制提供实验动物模型1.52009.72009.9针刺干预等在体实验整体动物试验完成2009.102009.12颈动脉组织病理切片、免疫组化、原位杂交测定各项指标完成部分实验指标检测1.52010.12010.3继续上述工作完成全部实验指标检测1.52010.42010.6临床观察完成20例病例观察1.02010.72010.9临床观察完成20例病例观察1.02010.102010.12临床观察完成全部临床观察1.02011.120