生物化学蛋白质(2)ppt课件

1、第五节第五节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的沉淀反响三、蛋白质的沉淀反响四、蛋白质的变性和复性四、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的颜色反响五、蛋白质的颜色反响一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质+OH+H+OH+H+COOHPrH3N+COOPrH3N+COOPrH2NpH pI pH = pI pH pI 由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸所由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸所具有的两性游离性质，蛋白质也同样具有。具有的两性游离性质，蛋白质也同样具有。 一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质w当蛋白

2、质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白值时，蛋白质解离成正离子和负离子的趋势相等，质解离成正离子和负离子的趋势相等，为兼性离子，即总净电荷为零，此时在为兼性离子，即总净电荷为零，此时在电场中，蛋白质分子既不向阳极挪动，电场中，蛋白质分子既不向阳极挪动，也不向阴极挪动，这个也不向阴极挪动，这个pH值称为蛋白质值称为蛋白质的等电点，用的等电点，用pI来表示。来表示。二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质分散相质点小于分散相质点小于1 nm时称为真溶液，分时称为真溶液，分散相质点大于散相质点大于100 nm时称为悬浊液，而分时称为悬浊液，而分散相质点在散相质点在1100 nm之间时称为胶

3、体溶液。之间时称为胶体溶液。蛋白质在水溶液中的颗粒约为蛋白质在水溶液中的颗粒约为1100 nm，所以蛋白质溶液属于胶体系统，是一种亲所以蛋白质溶液属于胶体系统，是一种亲水胶体，蛋白质分子颗粒是分散相，水是水胶体，蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。分散介质。蛋白质溶液也具有布朗运动、丁达尔效蛋白质溶液也具有布朗运动、丁达尔效应以及不能透过半透膜等性质。应以及不能透过半透膜等性质。二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质利用蛋白质不能透过半透膜的性质，常利用蛋白质不能透过半透膜的性质，常将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋中，置于流水中逐渐将小分子杂质除去

4、，袋中，置于流水中逐渐将小分子杂质除去，起到纯化的目的，这种方法即为透析。起到纯化的目的，这种方法即为透析。利用蛋白质不能透过半透膜的性质开展利用蛋白质不能透过半透膜的性质开展了的另一蛋白质纯化方法了的另一蛋白质纯化方法超滤。超滤。二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质构成水化层构成水化层构成双电层构成双电层为什么蛋白质具为什么蛋白质具有胶体性质有胶体性质三、蛋白质的沉淀反响三、蛋白质的沉淀反响1盐析和盐溶法盐析和盐溶法2有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法3重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法4生物碱试剂以及某些酸类生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质沉淀蛋白质5加热凝固加热凝固1盐析和盐溶法盐析和盐溶法等电

5、点时，无电荷间的相互作用，聚合沉淀；参与少量盐等电点时，无电荷间的相互作用，聚合沉淀；参与少量盐离子后破坏了这种作用，使分子分散，溶于水中离子后破坏了这种作用，使分子分散，溶于水中1盐析和盐溶法盐析和盐溶法盐溶：少量的中性盐，会添加蛋白质分子外盐溶：少量的中性盐，会添加蛋白质分子外表的电荷，加强蛋白质分子与水分子的作用，表的电荷，加强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。原理：蛋白质吸附某种盐离子原理：蛋白质吸附某种盐离子双电层双电层蛋蛋白质彼此排斥。白质彼此排斥。 蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，因蛋白质分子与水分子间的相互作用

6、加强，因此溶解度提高。此溶解度提高。1盐析和盐溶法盐析和盐溶法盐析盐析蛋白质分子外表聚集了许多水分子，当盐浓度高时，水分蛋白质分子外表聚集了许多水分子，当盐浓度高时，水分子被盐抽出，蛋白质的疏水区域暴露并相互结合，沉淀。子被盐抽出，蛋白质的疏水区域暴露并相互结合，沉淀。1盐析和盐溶法盐析和盐溶法盐析：向蛋白质溶液中参与高浓度的中性盐析：向蛋白质溶液中参与高浓度的中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层，同盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层，同时中和了蛋白质的电荷，降低了蛋白质的溶时中和了蛋白质的电荷，降低了蛋白质的溶解度，从而使蛋白质沉淀。解度，从而使蛋白质沉淀。常用：以硫酸铵中性盐最常运用。因

7、常用：以硫酸铵中性盐最常运用。因其溶解度大，且不易损伤蛋白质，另外还有其溶解度大，且不易损伤蛋白质，另外还有硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等。硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等。2有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。如酒精的消毒作用。沉淀。如酒精的消毒作用。在低温条件下，变性进展较缓慢，可以用在低温条件下，变性进展较缓慢，可以用来制备蛋白质。其优点在于：不像盐析那样来制备蛋白质。其优点在于：不像盐析那样存在有大量盐类，必需经透析除去，而且有存在有大量盐类，必需经透析除

8、去，而且有机溶剂很易经过稀释透析及蒸发等方法除去。机溶剂很易经过稀释透析及蒸发等方法除去。3重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法wpH稍大于等电点为宜，由于此时蛋白质带负稍大于等电点为宜，由于此时蛋白质带负电，易与金属离子结合成盐。电，易与金属离子结合成盐。w通常这种沉淀为变性的，如控制温度低温通常这种沉淀为变性的，如控制温度低温并控制重金属离子浓度，那么可用于分别制备并控制重金属离子浓度，那么可用于分别制备不变性的蛋白质。不变性的蛋白质。4生物碱试剂以及某些酸生物碱试剂以及某些酸 类沉淀蛋白质类沉淀蛋白质w某些生物碱试剂如苦味酸、钨酸、鞣酸、某些生物碱试剂如苦味酸、钨酸、鞣酸、碘化钾等及某些酸三氯乙

9、酸、水杨磺酸、碘化钾等及某些酸三氯乙酸、水杨磺酸、硝酸等与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。硝酸等与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。w沉淀条件该当是沉淀条件该当是pH小于等于电点，这样蛋小于等于电点，这样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。5加热凝固加热凝固w将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热可使蛋白质发生凝固而沉下。可使蛋白质发生凝固而沉下。w鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都变成固体样的东西了。变成固体样的东西了。四、蛋白质的变性和复性四、蛋白质的变性和复性1蛋白量变性的概念蛋白量变性的概念2蛋

10、白量变性的诱因与结果蛋白量变性的诱因与结果3蛋白量变性的机理蛋白量变性的机理4蛋白质的复性蛋白质的复性1蛋白量变性的概念蛋白量变性的概念蛋白量变性是指经过某些物理或化学蛋白量变性是指经过某些物理或化学要素的作用，使蛋白质天然的空间构象要素的作用，使蛋白质天然的空间构象破坏，从而引起蛋白质假设干理化和生破坏，从而引起蛋白质假设干理化和生物学性质的改动。物学性质的改动。蛋白量变性作用的本质是维持蛋白质蛋白量变性作用的本质是维持蛋白质分子高级构造的次级键和二硫键被破坏，分子高级构造的次级键和二硫键被破坏，引起天然构象解体，但维持主链的共价引起天然构象解体，但维持主链的共价键肽键并未被打断，即一级构造

11、坚持键肽键并未被打断，即一级构造坚持完好。完好。1蛋白量变性的概念蛋白量变性的概念2蛋白量变性的诱因与结果蛋白量变性的诱因与结果能使蛋白量变性的要素很多，可分能使蛋白量变性的要素很多，可分为化学要素和物理要素两大类。为化学要素和物理要素两大类。化学要素有强酸、强碱、尿素、胍、化学要素有强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、三氯醋酸、磷钨去污剂、重金属盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇等。酸、苦味酸、浓乙醇等。物理要素有加热物理要素有加热70100、猛烈振荡或搅拌、紫外线及猛烈振荡或搅拌、紫外线及X射线照射线照射、超声波等。射、超声波等。 2蛋白量变性的诱因与结果蛋白量变性的诱因与结果蛋白量

12、变性后，经常会有如下表现蛋白量变性后，经常会有如下表现:生物学活性丧失生物学活性丧失;某些侧链基团暴显露来某些侧链基团暴显露来;生物化学性质的改动生物化学性质的改动;一些理化性质改动一些理化性质改动;3蛋白质的复性蛋白质的复性复性复性:某些变性蛋白质，再除去变性要素某些变性蛋白质，再除去变性要素后，可以后，可以“复性复性 。蛋白质的复性是一个非常复杂的过程，除了要去蛋白质的复性是一个非常复杂的过程，除了要去除变性要素，多数蛋白还需求一些其他要素的协除变性要素，多数蛋白还需求一些其他要素的协助来恢复蛋白质的正确折叠。在复性过程中，不助来恢复蛋白质的正确折叠。在复性过程中，不同的蛋白质充分表达出本

13、身的特性，没有可以通同的蛋白质充分表达出本身的特性，没有可以通用的方法。用的方法。 五、蛋白质的颜色反响五、蛋白质的颜色反响蛋白质的颜色反响是指利用蛋白质的构蛋白质的颜色反响是指利用蛋白质的构造或利用肽键、以及酚基等特殊氨基酸残造或利用肽键、以及酚基等特殊氨基酸残基的特性，使其与一些试剂发生反响而生基的特性，使其与一些试剂发生反响而生成有色物质。成有色物质。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸的一些颜蛋白质由氨基酸组成，氨基酸的一些颜色反响蛋白质往往也都具有。色反响蛋白质往往也都具有。氨基酸所没有的一些颜色反响，主要是氨基酸所没有的一些颜色反响，主要是双缩脲反响，是蛋白质常用的定量分析方双缩脲反响，是蛋

14、白质常用的定量分析方法。法。五、蛋白质的颜色反响五、蛋白质的颜色反响原理原理:蛋白质分子中含有许多和双缩脲构造蛋白质分子中含有许多和双缩脲构造类似的肽键，因此也能起双缩脲反响，构成类似的肽键，因此也能起双缩脲反响，构成红紫色混合物。红紫色混合物。运用运用:可以用此反响来定性测定蛋白质；也可以用此反响来定性测定蛋白质；也可在可在540nm处比色，定量测定蛋白质。处比色，定量测定蛋白质。五、蛋白质的颜色反响五、蛋白质的颜色反响2H2NC NH2H2NCNCNH2NH31320COOHO尿素尿素双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲CuSO4+NaOH紫红色物质紫红色物质第五节第五节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化

15、性质氨基酸氨基酸性质性质蛋白质蛋白质性质性质两性两性性质性质物理物理性质性质两性两性性质性质紫外紫外吸收吸收化学化学性质性质分别纯分别纯化测定化测定盐析盐析等电点等电点凝胶凝胶过滤过滤分子分子大小大小胶体胶体性质性质沉淀沉淀作用作用NH2COOH共同共同R基基颜色颜色反响反响含量含量测定测定变性变性复性复性离子离子交换交换电泳电泳含量含量测定测定第六节第六节 氨基酸及蛋白质的分析和分别氨基酸及蛋白质的分析和分别一、氨基酸的分析分别一、氨基酸的分析分别二、蛋白质的分别和纯化二、蛋白质的分别和纯化三、蛋白质的定量检测三、蛋白质的定量检测四、蛋白质的纯度分析四、蛋白质的纯度分析一、氨基酸的分析分别一

16、、氨基酸的分析分别1层析法的根本原理层析法的根本原理2常用的氨基酸层析方法常用的氨基酸层析方法类型：分配层析法类型：分配层析法( (包括柱层析、纸包括柱层析、纸层析和薄层层析层析和薄层层析) )。根本原理：一切的层析系统通常都为根本原理：一切的层析系统通常都为两个相组成。一个为固定相的或静相；两个相组成。一个为固定相的或静相；一个为流动相或动相。一个为流动相或动相。1层析法的根本原理层析法的根本原理 利用层析法分别混合物，例如氨基酸混合利用层析法分别混合物，例如氨基酸混合物，其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数物，其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差别，哪怕是很小的差别，普通差别越大，要

17、有差别，哪怕是很小的差别，普通差别越大，越容易分开。越容易分开。 1层析法的根本原理层析法的根本原理2常用的氨基酸层析方法常用的氨基酸层析方法1纸层析纸层析2薄层层析薄层层析3离子交换层析离子交换层析4高效高压液相色谱高效高压液相色谱1纸层析纸层析纸层析是利用混合物各组分在流动相和固纸层析是利用混合物各组分在流动相和固定相两种不同溶剂中分配系数的差别，将它定相两种不同溶剂中分配系数的差别，将它们别分开。们别分开。纸层析以滤纸为隋性支持物，滤纸纤维和纸层析以滤纸为隋性支持物，滤纸纤维和水有较强的亲和力，在普通条件下较难脱去，水有较强的亲和力，在普通条件下较难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱

18、，所以而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱，所以纸层析的固定相是被滤纸纤维吸附的结合水。纸层析的固定相是被滤纸纤维吸附的结合水。纸层析以有机溶剂为流动相，也称为层析液，纸层析以有机溶剂为流动相，也称为层析液，在毛细拉力的作用下，层析液能不断由下向在毛细拉力的作用下，层析液能不断由下向上流动。上流动。1纸层析纸层析层析时，混合氨基酸在水和有机相之间层析时，混合氨基酸在水和有机相之间不断进展分配，使它们分布在滤纸的不同不断进展分配，使它们分布在滤纸的不同位置，从而使物质得到分别和提纯。位置，从而使物质得到分别和提纯。最后用茚三酮显色。最后用茚三酮显色。1纸层析纸层析氨基酸的混合物点氨基酸的混合物点在滤

19、纸的一个角上，在滤纸的一个角上，把这个点称为原点。把这个点称为原点。氨基酸在滤纸上挪氨基酸在滤纸上挪动的速度称为比移值动的速度称为比移值或迁移率，以符号或迁移率，以符号Rf代表。代表。Rf也就是原点也就是原点到层析斑点即原色到层析斑点即原色点中心的间隔点中心的间隔(DA)与原点到溶剂前沿的与原点到溶剂前沿的间隔间隔Ds的比值。的比值。RfDA/ DS 2薄层层析薄层层析薄层层析的根本原理是利用混合物各组薄层层析的根本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附性能、溶解性能分在某一物质中的吸附性能、溶解性能即分配或者其它亲和作用性能的差别，即分配或者其它亲和作用性能的差别，使混合物溶液中的各种物质

20、，进展反复的使混合物溶液中的各种物质，进展反复的吸附或者分配等作用，从而将各种组分分吸附或者分配等作用，从而将各种组分分开。开。根据分别的原理不同，薄层层析可以分根据分别的原理不同，薄层层析可以分为吸附薄层层析和分配薄层层析两类。为吸附薄层层析和分配薄层层析两类。2薄层层析薄层层析3离子交换层析离子交换层析离子交换层析是一种用离子交换剂作为离子交换层析是一种用离子交换剂作为支持剂的层析方法。支持剂的层析方法。分别原理是在一定离子强度和分别原理是在一定离子强度和pH等条件等条件下，由于样品中目的纯化分子和杂质分子下，由于样品中目的纯化分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附与解吸才干不同，到与吸附剂之间

21、的吸附与解吸才干不同，到达分别纯化目的分子的目的。达分别纯化目的分子的目的。普通需经过加样、吸附、洗涤、洗脱和普通需经过加样、吸附、洗涤、洗脱和凝胶再生几个环节。凝胶再生几个环节。 3离子交换层析离子交换层析3离子交换层析离子交换层析常用于氨基酸分别的离子交换剂是树脂。常用于氨基酸分别的离子交换剂是树脂。带有正电荷的树脂称之为阴离子交换树脂。带有正电荷的树脂称之为阴离子交换树脂。而带有负电荷的称之为阳离子树脂。它而带有负电荷的称之为阳离子树脂。它们分别和不同带电性质的离子基团发生离们分别和不同带电性质的离子基团发生离子交换。子交换。 4高效高压液相色谱高效高压液相色谱液相色谱法是以液体为载体，

22、将样品带入液相色谱法是以液体为载体，将样品带入色谱仪进展分析的方法。色谱仪进展分析的方法。高效液相色谱高效液相色谱HPLC采用了高压泵、采用了高压泵、高效分别柱、高灵敏度检测器等，使分别效高效分别柱、高灵敏度检测器等，使分别效能、分析速度、检测灵敏度比经典液相色谱能、分析速度、检测灵敏度比经典液相色谱有了很大的提高。有了很大的提高。HPLC适用于分析分别不易挥发的极性物适用于分析分别不易挥发的极性物质。质。 4高效高压液相色谱高效高压液相色谱w高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分别系统、检测系统、记录系统等五大部分分别系统、检测系统、记录系统等五大

23、部分组成。组成。 4高效高压液相色谱高效高压液相色谱氨基酸的高效液相色谱图氨基酸的高效液相色谱图 二、蛋白质的分别和纯化二、蛋白质的分别和纯化 1蛋白质分别纯化的普通步骤蛋白质分别纯化的普通步骤 2蛋白质分别纯化的常用方法蛋白质分别纯化的常用方法 1蛋白质分别纯化的普通步骤蛋白质分别纯化的普通步骤1资料的预处置及细胞破碎资料的预处置及细胞破碎2蛋白质的抽提蛋白质的抽提3蛋白质粗制品的获得蛋白质粗制品的获得4样品的进一步分别纯化样品的进一步分别纯化1资料的预处置及细胞破碎资料的预处置及细胞破碎预处置的主要目的是去除原资料中的部分预处置的主要目的是去除原资料中的部分可溶性杂质，分别含有蛋白的细胞。

24、可溶性杂质，分别含有蛋白的细胞。分别提纯某一种蛋白质时，首先要采用适分别提纯某一种蛋白质时，首先要采用适当的方法将组织和细胞破碎。当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎方法有：机械破碎法、浸透破常用的破碎方法有：机械破碎法、浸透破碎法、反复冻融法对温度变化敏感的蛋白碎法、反复冻融法对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法、超声波法和酶法等。机质不宜采用此法、超声波法和酶法等。机械破碎法是最常用的细胞破碎方法械破碎法是最常用的细胞破碎方法 。1资料的预处置及细胞破碎资料的预处置及细胞破碎选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白别分开来，首先获得蛋白质粗制品。蛋白别分开

25、来，首先获得蛋白质粗制品。方便有效的方法是根据蛋白质溶解度的差方便有效的方法是根据蛋白质溶解度的差别进展分别。别进展分别。常用以下几种方法：等电点沉淀法、盐析常用以下几种方法：等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法。法、有机溶剂沉淀法。 2蛋白质的抽提蛋白质的抽提选择适当的缓冲液把蛋白质提取出来，即选择适当的缓冲液把蛋白质提取出来，即为蛋白质的抽提。为蛋白质的抽提。抽提所用缓冲液的抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备蛋白质的性成分等条件的选择应根据欲制备蛋白质的性质而定。质而定。在抽提过程中，应留意选择适宜的温度条在抽提过程中，应留意选择适宜的温度条件

26、，防止猛烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。件，防止猛烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 3蛋白质粗制品的获得蛋白质粗制品的获得常用的方法有：层析法凝胶过滤层析、常用的方法有：层析法凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等；电泳法和超离子交换层析、亲和层析等；电泳法和超离心法等。离心法等。有时还需求这几种方法结合运用才干得到有时还需求这几种方法结合运用才干得到较高纯度的蛋白质样品较高纯度的蛋白质样品 。2蛋白质分别纯化的常用方法蛋白质分别纯化的常用方法1根据蛋白质分子大小不同的纯化方法根据蛋白质分子大小不同的纯化方法2利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法3根据电荷不同的纯化方法根据电荷不同的纯

27、化方法4利用选择性吸附的纯化方法利用选择性吸附的纯化方法5利用对配体的特异亲和力的纯化方法利用对配体的特异亲和力的纯化方法1根据蛋白质分子大小不同的纯化方法根据蛋白质分子大小不同的纯化方法透析法透析法超滤法超滤法 离心法离心法凝胶过滤法凝胶过滤法 1根据蛋白质分子大小不同的纯化方法根据蛋白质分子大小不同的纯化方法血液透析血液透析小分子溶出小分子被小分子被带出带出透析机透析机透析液透析液血液血液加加压压透析透析w透析法是利用蛋白透析法是利用蛋白质的分子比较大，不质的分子比较大，不能透过半透膜的特点，能透过半透膜的特点，实现蛋白质与小分子实现蛋白质与小分子物质分别的方法。物质分别的方法。1根据蛋白

28、质分子大小不同的纯化方法根据蛋白质分子大小不同的纯化方法超滤超滤w利用一定的压力使利用一定的压力使样品经过半透膜，这样品经过半透膜，这时，小分子和水组成时，小分子和水组成的溶质可以被滤过，的溶质可以被滤过，而大分子的蛋白质那而大分子的蛋白质那么留在膜内，这种方么留在膜内，这种方法称为超滤法，亦称法称为超滤法，亦称微滤法。微滤法。1根据蛋白质分子大小不同的纯化方法根据蛋白质分子大小不同的纯化方法离心分别是利用离心惯性力的作用分别非离心分别是利用离心惯性力的作用分别非均相混合物的方法。均相混合物的方法。由于悬浮液中颗粒的沉降速率不仅取决于由于悬浮液中颗粒的沉降速率不仅取决于颗粒本身的性质，而且也取

29、决于悬浮颗粒介颗粒本身的性质，而且也取决于悬浮颗粒介质以及作用在颗粒上的力，因此常采用密度质以及作用在颗粒上的力，因此常采用密度梯度离心法对蛋白质进展分别。梯度离心法对蛋白质进展分别。密度梯度离心法是在离心管中经过某种介密度梯度离心法是在离心管中经过某种介质来提供一个密度梯度环境，然后参与待分质来提供一个密度梯度环境，然后参与待分别的物质，经过离心的方法到达分别的目的。别的物质，经过离心的方法到达分别的目的。离心法离心法蔗糖浓度蔗糖浓度48121620塑料离心管塑料离心管滴加样品滴加样品蛋白质蛋白质的位置决的位置决议于它的议于它的大小，密大小，密度。度。1根据蛋白质分子大小不同的纯化方法根据蛋

30、白质分子大小不同的纯化方法离心法离心法1根据蛋白质分子大小不同的纯化方法根据蛋白质分子大小不同的纯化方法凝胶过滤层析也称为分子筛层析，可以凝胶过滤层析也称为分子筛层析，可以对含有不同大小分子的混合物进展分别。对含有不同大小分子的混合物进展分别。凝胶过滤层析是经过一定的载体来实现凝胶过滤层析是经过一定的载体来实现的，载体的孔径不同，分别的分子大小范的，载体的孔径不同，分别的分子大小范围也不一样。围也不一样。分别过程是基于蛋白质在自在流动溶剂分别过程是基于蛋白质在自在流动溶剂和存在于多孔凝胶中的固定溶剂间的分配。和存在于多孔凝胶中的固定溶剂间的分配。凝胶过滤法凝胶过滤法 3根据电荷不同的纯化方法根

31、据电荷不同的纯化方法A A 装好的凝胶过滤层析柱；装好的凝胶过滤层析柱； B B 蛋白质混合物上样；蛋白质混合物上样； C C 不同大小的蛋白质分子经不同大小的蛋白质分子经过层析柱；过层析柱； D D 蛋白出峰图；蛋白出峰图；凝胶过滤法凝胶过滤法 利用凝胶过滤层析，除了可以利用凝胶过滤层析，除了可以进展混合物的分别外，还能测进展混合物的分别外，还能测定样品的相对分子质量。定样品的相对分子质量。 2利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法溶液的溶液的pH会影响蛋白质的溶解度。会影响蛋白质的溶解度。 溶液中的盐离子浓度也会影响蛋溶液中的盐离子浓度也会影响蛋白质的溶解度。白质的溶解度。溶剂的

32、极性同样会影响蛋白质的溶剂的极性同样会影响蛋白质的溶解度。溶解度。2利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法当溶液的当溶液的pH与蛋白质的等电点一样时，与蛋白质的等电点一样时，蛋白质分子呈现电中性，分子间无斥力，蛋白质分子呈现电中性，分子间无斥力，分子易于积聚和沉淀，此时蛋白质的溶分子易于积聚和沉淀，此时蛋白质的溶解度是最小的，这种使蛋白质沉淀的方解度是最小的，这种使蛋白质沉淀的方法称为等电点沉淀。法称为等电点沉淀。不同蛋白质具有不同的等电点，利用不同蛋白质具有不同的等电点，利用这一特性，可以经过改动溶液的这一特性，可以经过改动溶液的pH，使，使要分别的蛋白质沉降出来，这些蛋白质要分别

33、的蛋白质沉降出来，这些蛋白质依然可以坚持天然的生物学活性，该方依然可以坚持天然的生物学活性，该方法可以运用于蛋白质的粗分别。法可以运用于蛋白质的粗分别。2利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法盐溶景象。盐溶景象。盐析景象。盐析景象。2利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法与水混溶的有机溶剂能减少水和蛋白质与水混溶的有机溶剂能减少水和蛋白质间的作用力，使蛋白质脱水。间的作用力，使蛋白质脱水。有机溶剂的参与能降低溶液的介电常数，有机溶剂的参与能降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间的作用力加强，蛋白质分使蛋白质分子间的作用力加强，蛋白质分子易于聚集沉淀。子易于聚集沉淀。 3根据电荷

34、不同的纯化方法根据电荷不同的纯化方法电泳电泳离子交换层析离子交换层析电泳电泳电泳是溶液中带电粒子离子在电场中电泳是溶液中带电粒子离子在电场中挪动的景象。利用带电粒子在电场中挪动速挪动的景象。利用带电粒子在电场中挪动速度不同而使目的分子分别的技术称为电泳技度不同而使目的分子分别的技术称为电泳技术。术。在一定的在一定的pH溶液中，蛋白质的迁移方向取溶液中，蛋白质的迁移方向取决于它们带电的性质和数量，同时也受蛋白决于它们带电的性质和数量，同时也受蛋白质外形的影响。质外形的影响。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE可以完全根据蛋白质的相对可以完全根据蛋白质的

35、相对分子质量，来对蛋白质进展分别。分子质量，来对蛋白质进展分别。蛋白质电泳通常运用的支持物是聚丙烯酰蛋白质电泳通常运用的支持物是聚丙烯酰胺凝胶。胺凝胶。 电泳电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳表示图电泳表示图 电泳电泳等电聚焦在等电聚焦时，蛋白质分子是等电聚焦在等电聚焦时，蛋白质分子是在含有载体两性电解质构成的一个延续而在含有载体两性电解质构成的一个延续而稳定的线性稳定的线性pH梯度中进展电泳。梯度中进展电泳。不同等电点的蛋白质分子在等电聚焦电不同等电点的蛋白质分子在等电聚焦电泳终了后，会分别聚集于其等电点的位置，泳终了后，会分别聚集于其等电点的位置，这样不同的蛋白质分子就得以分别。这样

36、不同的蛋白质分子就得以分别。离子交换层析离子交换层析 是用离子交换树脂作支持剂的一种是用离子交换树脂作支持剂的一种层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性性基团的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性高分子化合物。高分子化合物。离子交换层析离子交换层析RCHCOOHNH3+M1A+RCHCOOHNH3M1+A+ 氨基酸在酸性溶液中阳离子阳离子交换剂交换剂 氨基酸盐RCHCOONH2+M2B RCHCOO M2NH2+ B 氨基酸在碱性溶液中阴离子阴离子交换剂交换剂 氨基酸盐M1为酸性基团，为酸性基团，M2为碱性基团为碱性基团4利用选择性吸附的纯

37、化方法利用选择性吸附的纯化方法吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附才干和解吸性质不同，与吸附剂之间的吸附才干和解吸性质不同，到达使它们分别的目的。到达使它们分别的目的。硅胶、氧化铝、活性炭等物质为固体吸附硅胶、氧化铝、活性炭等物质为固体吸附剂，可以将其它分子吸附在外表。剂，可以将其它分子吸附在外表。吸附层析的分别效果，决议于吸附剂、溶吸附层析的分别效果，决议于吸附剂、溶剂和蛋白质的性质三个要素。剂和蛋白质的性质三个要素。 5利用对配体的特异亲和力的纯化方法利用对配体的特异亲和力的纯化方法原理：利用蛋白质分子能与其相对应原理：利用蛋白质分子能

38、与其相对应的配体进展特异的、非共价的、可逆的的配体进展特异的、非共价的、可逆的结合来分别纯化，即亲和层析法。结合来分别纯化，即亲和层析法。配体：指能与某些蛋白质进展特异结配体：指能与某些蛋白质进展特异结合的化合物，如配体的作用物及抑制剂合的化合物，如配体的作用物及抑制剂、激素和受体、抗原和抗体、酶及底物、激素和受体、抗原和抗体、酶及底物等。等。5利用对配体的特异亲和力的纯化方法利用对配体的特异亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒亲和色谱颗粒三、蛋白质的定量检测三、蛋白质的定量检测1凯氏定氮法凯氏定氮法2紫外紫外-分光光度计法分光光度计法3双缩脲法双缩脲法Biuret法法4Folin-酚试剂法酚试剂法L

39、owry法法5考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250染色法染色法Bradford法法6BCA法法1凯氏定氮法凯氏定氮法原理：氮在蛋白质分子中含量恒定平均原理：氮在蛋白质分子中含量恒定平均占占16%，因此测出样品中氮的含量后，即，因此测出样品中氮的含量后，即可求得样品中蛋白质含量。可求得样品中蛋白质含量。每克样品中含氮的克数每克样品中含氮的克数6.25100=100克克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量克%。2紫外紫外-分光光度计法分光光度计法由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸在由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，所以在左右具有最大吸收，所以在280nm吸收吸收值与浓度成正比

40、，可用于蛋白质含量测定值与浓度成正比，可用于蛋白质含量测定蛋白质浓度蛋白质浓度mg/ml=1.45A2800.74 A260由于此法非常简便，条件要求低，因此常作由于此法非常简便，条件要求低，因此常作为粗略定量蛋白质的方法来运用为粗略定量蛋白质的方法来运用 。3双缩脲法双缩脲法Biuret法法包含肽键基团的化合物能与硫酸铜包含肽键基团的化合物能与硫酸铜-氢氧氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反响，生成紫红化钠溶液产生双缩脲颜色反响，生成紫红色或蓝紫色的复合物。色或蓝紫色的复合物。在在540 nm处测定其吸光值，此值与蛋白处测定其吸光值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。质的含量在一定范围内呈线

41、性关系。双缩脲法的测定范围为双缩脲法的测定范围为110 mg蛋白质。蛋白质。优点是快速，缺陷是灵敏度差。优点是快速，缺陷是灵敏度差。4Folin-酚试剂法酚试剂法Lowry法法又叫又叫Lowry法法其原理是碱性铜试剂与蛋白质发生双缩脲反响，其原理是碱性铜试剂与蛋白质发生双缩脲反响，然后蛋白质中的酚基如酪氨酸在碱性条件下很然后蛋白质中的酚基如酪氨酸在碱性条件下很容易将混合试剂含有磷钼酸和磷钨酸复原或蓝容易将混合试剂含有磷钼酸和磷钨酸复原或蓝色的钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与蛋白质含量成正色的钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，在比，在650660nm下测定光吸收值，即可测定蛋白下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。质含量。此法比双缩脲法灵敏此法比双缩脲法灵敏100倍。蛋白质丈量范围在倍。蛋白质丈量范围在25250mg/ml，因此是通用的方法之一。但其受复，因此是通用的方法之一。但其受复原剂、原剂、EDTA、Tritonx-100及酚的影响，并且蛋白及酚的影响，并且蛋白质的种类不同，有较大的变动。质的种类不同，有较大的变动。5考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250染色法染色法Bradford法法用考马思亮兰用考马思亮兰G-250染色蛋白质，出现的染色蛋白质，出现的颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。其颜色在颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。其颜色在595nm的光波下，有剧