一株草甘膦降解菌分离鉴定及其降解特性研究

1、第3期一株草甘膦降解菌分离鉴定及其降解特性研究叶明,陈九山,姚晓庆(合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009摘要:从长期受草甘膦污染的土壤中筛选出10株草甘膦降解菌,其中A5菌株对草甘膦的降解率最高,经鉴定该菌株属于节杆菌属(Arthrobacter 。对A5菌株进行降解特性研究,结表明,该菌株降解草甘膦最适条件为:草甘膦600mg/L ,葡萄糖10g/L ,NaCl 0.5g/L ,pH 6.5,32。在最适降解条件下,该菌株在72h 时对草甘膦的降解率达94.2%。关键词:草甘膦;节杆菌属;降解特性中图分类号:X172文献标志码:A文章编号:1003-6504(200903-0

2、039-03Isolation and Identification of a Gyphosate-degrading Strain andIts Degradation CharacteristicsYE Ming ,CHEN Jiu-shan ,YAO Xiao-qing(School of Biotechnology and Food Engineering ,Hefei University of Technology ,Hefei 230009,China Abstract :10gyphosate degradable strains were isolated from cont

3、aminated soil by gyphosate ,in which strain A5displayed the highest degradation.It was identified as Arthrobacter .Optimal conditions for gyphosate degradation of strain A5was gyphosate 600mg/L ,glucose 10g/L ,NaCl 0.5g/L ,pH 6.5and 32.Under the best degradation ,degradation rate of gyphosate in 72h

4、 was above 94.2%.Key words :gyphosate ;Arthrobacter ;degrading characteristics草甘膦是一种高效、低毒的有机磷类除草剂,化学名称为N-膦酸甲基-甘氨酸,商品名为农达,但是长期施用对非靶标生物和环境均造成不可低估的破坏作用,尤其是对水生生物及土壤微生物等具有较强毒害作用1-2。多年来,草甘膦使用之后的环境效应及其修复技术越来越受到学者们的关注3-6。本研究从长期施用草甘膦的土壤中分离出草甘膦高效降解菌,并对其降解特性进行研究,以期为草甘膦的生物降解与污染土壤的生物修复提供理论依据。1材料与方法1.1土壤样品合肥市七里塘镇

5、和文昌村长期施用草甘膦农药的污染土壤。1.2培养基基础培养基(g/L :KH 2PO 40.5,K 2HPO 41.5,NaCl 0.5,MgSO 47H 2O 0.5,CaCl 20.04。1.3试剂市售10%草甘膦水剂(安徽锦邦化工股份有限公司生产。 1.4降解菌分离与纯化将土壤样品进行风干、去杂、磨细、混匀,用无菌水溶解,系列稀释,分别涂布在含有800mg/L 草甘膦的基础培养基平板上,30下培养3d ,挑取单菌落,反复划线分离纯化,接入斜面于冰箱4保存。1.5菌株鉴定依据常见细菌系统鉴定手册7方法进行。1.6草甘膦含量测定依据文献8所述方法进行。1.7菌体生物量测定用721分光光度计在

6、600nm 波长处的吸光度(OD表示。1.8优势菌最适生长条件确定分别将优势菌置于不同的草甘膦浓度、pH 、温度、不同葡萄糖浓度和不同NaCl 浓度等条件下进行培养,测定其生物量与草甘膦的降解率,3次重复。2结果与分析2.1菌株的筛选通过4次富集培养,共分离筛选到10株能以草收稿日期:2008-01-03;修回2008-03-20基金项目:安徽省年度重点计划项目资助(07020303053作者简介:叶明(1959-,男,教授,博士,硕士生导师,主要从事微生物资源与应用研究,(电子信箱forevercredit 。Environmental Science &Technology第32卷第3期2

7、009年3月Vol.32No.3Mar.2009第32卷 甘膦为唯一碳氮源的菌株,编号为A1A10,分别测定其降解率,其结果见表1。 由表1可以看出,菌株A5对草甘膦的降解率明显高于其它菌株,对草甘膦的降解率达到82.4%,故选择A5菌株为出发菌株。2.2A5菌株的鉴定通过常规细菌学鉴定,A5菌株的生理生化反应结果为:氧化酶阴性,接触酶阳性,MR 为阴性,硝酸盐还原阳性,VP 反应为阴性,吲哚反应为阴性,淀粉水解阳性,不水解明胶,赖氨酸脱羧酶阳性,鸟氨酸脱羧酶阳性,苯丙氨酸脱氨酶为阴性,对照常见细菌系统鉴定手册,初步鉴定A5菌株为节杆菌属(Arthrobacter 。2.3A5菌株最适生长条件

8、的确定2.3.1草甘膦浓度对A5菌株降解率的影响以草甘膦为唯一碳氮源,分别将A5菌株置于不同草甘膦浓度的基础培养基中,30培养72h 时测定培养液的吸光度及草甘膦降解率,结果见图1。 由图1可以看出草甘膦浓度在200600mg/L 时,随着草甘膦浓度的增加,A5菌株生物量也同步增加,草甘膦降解率也随之升高,当草甘膦的浓度达到600mg/L 时,其降解率最高。但当草甘膦浓度在600900mg/L 时,随着草甘膦浓度的增加,A5菌株生物量逐渐降低,草甘膦降解率也随之下降。由此可知,A5菌株降解草甘膦的最适浓度为600mg/L 。2.3.2pH 值对A5菌株降解率的影响分别调整基础培养基的pH 为5

9、.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,将A5菌株接种于600mg/L 草甘膦的培养基中置于30培养72h 时测定发酵液的吸光度及菌株对草甘膦的降解率,结果见图2。由图2可知,当pH 在5.56.5时,随着发酵液pH值的升高,A5菌株生物量逐渐增加,草甘膦降解率也随之升高,pH 值为6.5时降解率最高达到91.3%。但当pH 在6.58.5时,随着pH 值的升高,A5菌株生物量逐渐减小,草甘膦的降解率也逐渐降低。由此可知,A5菌株降解草甘膦的最适pH 值为6.5。2.3.3温度对A5菌株降解率的影响将A5菌株置于草甘膦浓度为600mg/L ,pH 值为6.5的基础培养基中分别于2

10、6,28,30,32,34,36和38条件下培养72h 时测定发酵液的吸光度及菌株对草甘膦的降解率,结果如图3所示。由图3可以看出在2632时,随着温度的升高,A5菌株生物量逐渐增加,草甘膦降解率也随之升高,当温度升到32时,草甘膦降解率达到最大。但在3238时,随着温度的升高,A5菌株生物量逐渐减少,草甘膦的降解率随之降低。由此可知,A5菌株降解草甘膦的最适温度为32。2.3.4葡萄糖对A5菌株降解率的影响葡萄糖作为微生物最重要的碳源之一,我们试图通过添加葡萄糖来提高菌株生物量,从而提高草甘膦的降解率,所以将A5菌株置于草甘膦浓度为600mg/L ,pH 值为6.5,温度为32,调节葡萄糖浓

11、度分别为0,5,10,15,20g/L ,72h 时测定发酵液的吸光度及菌株对草甘膦的降解能力,结果如图4。表1草甘膦降解菌的降解率Table 1The degradation efficiency of gyphosate strains菌株降解率(%菌株降解率(%A125.6A650.2A234.2A762.5A346.7A853.1A455.7A963.0A582.4A1042.6第3期由图4可以看出,当葡萄糖浓度在010g/L时,随着葡萄糖浓度的升高,A5菌株生物量逐渐增加,当葡萄糖浓度为10g/L时,草甘膦降解率最高达到92.3%。但当葡萄糖浓度在1020g/L时,随着葡萄糖浓度的升

12、高,菌株生物量逐渐减少,草甘膦降解率也随之降低。由此可知,A5菌株降解草甘膦的最适葡萄糖浓度为10g/L。2.3.5NaCl对A5菌株降解率的影响将A5菌株置于草甘膦浓度为600mg/L,pH值为6.5,温度为32,葡萄糖浓度为10g/L,然后分别加入NaCl浓度为0,0.2,0.5,0.8,1.0g/L,72h时测定发酵液的吸光度及菌株对草甘膦的降解率,结果见图5。由图5可以看出,当NaCl浓度在00.5g/L时,随着NaCl浓度的升高,菌株的生物量逐渐增加,草甘膦降解率随之升高,当NaCl浓度为0.5g/L时,草甘膦降解率最高达到94.2%。但当NaCl浓度在0.51.0g/L 时,随着N

13、aCl浓度的升高,菌株生物量逐渐增加,草甘膦降解率也随之降低。由此可知,A5菌株降解草甘膦的最适NaCl浓度为0.5g/L。3小结(1从土壤中筛选得到1株降解草甘膦能力较强菌株A5,被初步鉴定为节杆菌属(Arthrobacter。(2菌株A5降解草甘膦的最佳条件为草甘膦600mg/L,葡萄糖10g/L,NaCl0.5g/L,pH6.5,32。(3本研究分离得到的节杆菌属(Arthrobacter中的A5菌株,在72h时对草甘膦的降解率达94.2%,与石成春等9分离得到的曲霉B12菌株对草苷膦的降解率基本接近。因此,该菌株可作为草甘膦农药的环境毒理与生物降解的研究材料,具有潜在的应用前景。参考文

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