基因工程的基本操作程序的步骤

1、用切目的基因相用切目的基因相同的限制性内切同的限制性内切酶切割质粒酶切割质粒目的基因目的基因目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序的步骤：基因工程的基本操作程序的步骤：目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1 1、什么是目的基因？、什么是目的基因？2 2、获取目的基因的方法有哪些？其操、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？作过程分别是怎样的？一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从（一）从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因 基因文库基因文库 定义（见课本定义（见课本p9p9

2、） 种类种类 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cdnacdna文库）文库）基因组文库的构建过程基因组文库的构建过程基基因因组组文文库库限制酶限制酶供体细胞的供体细胞的全部全部dna大量大量dna片段片段拼接到载体上拼接到载体上导入受体细胞扩增导入受体细胞扩增cdna文库的构建过程文库的构建过程mrnamrna单链单链dnadna 双链双链dnadna反转录反转录cdna文库文库互补合成互补合成依据目的基因的有关信息。依据目的基因的有关信息。如：根据如：根据 基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的

3、转录产物mrnamrna 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。pcrpcr的全称：的全称： 聚合酶链式反应聚合酶链式反应pcrpcr的原理：的原理： dnadna复制复制( (体外体外) ) pcrpcr技术扩增目的基因的前提条件：技术扩增目的基因的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。模板模板原料原料引物引物taq酶酶控制温度控制温度目的基因目的基因dnadna四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸如单链如单链dnadna分子片段分子片段热稳定的热稳定的dnadna聚合酶聚合酶pcrpcr仪自动调控仪自动调控pcrpcr的条件：的条件：（高温

4、变性，低温复性，中温延伸）（高温变性，低温复性，中温延伸）pcrpcr的过程：的过程：目的基因目的基因dnadna受热受热变性变性而而解链解链 ( (90-9590-95)引物引物与与dnadna单链单链互补结合互补结合( (55-6055-60)dnadna聚合酶聚合酶催化延伸催化延伸合成新链合成新链( (70-7570-75)（高温变性，低温复性，中温延伸高温变性，低温复性，中温延伸）pcr技术与技术与dna复制的比较复制的比较比较项目比较项目pcr技术技术dna复制复制相同点相同点原则原则碱基互补配对碱基互补配对原料原料4种游离的脱氧核苷酸种游离的脱氧核苷酸模板模板dna双链双链不同点不

5、同点解旋方式解旋方式加热加热解旋酶解旋酶场所场所体外体外细胞核细胞核酶酶taq酶酶细胞内的细胞内的dna聚合酶聚合酶结果结果大量的大量的dna片段片段形成整个的形成整个的dna分子分子条件：条件：仪器：仪器：基因较小，核苷酸序列已知。基因较小，核苷酸序列已知。dnadna合成仪合成仪二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建复制原点复制原点+目的基因目的基因+标记基因标记基因+启动子启动子+终止子终止子 各元件具有怎样的功能？各元件具有怎样的功能？标记基因：用于鉴别受体细胞中是否含标记基因：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因。有目的基因。复制原点：载体自我复制的起点复制原点：载体自我复制的起

6、点1、元件：、元件：启动子：启动子：终止子：终止子： 位于基因尾端，位于基因尾端，转录停止转录停止的信号的信号 位于基因首端，位于基因首端，rnarna聚合酶识别和结合的部位，聚合酶识别和结合的部位，驱动驱动基因基因转录转录出出mrnamrna2 2、基因表达载体的构建目的：、基因表达载体的构建目的：a.a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。并且可以遗传给下一代。b.b.使目的基因能够表达和发挥作用。使目的基因能够表达和发挥作用。载体与基因表达载体的区别：载体与基因表达载体的区别：同：二者均有同：二者均有标记基因标记基因和和复制原点复制原点异

7、：表达载体在载体的基础上增加了异：表达载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、目的基因、启动子、 终止子终止子三部分结构三部分结构（其中启动子、终止子对于目的基因的表达（其中启动子、终止子对于目的基因的表达（转录步骤）（转录步骤）必不可少）必不可少）载体的组成：载体的组成： 复制原点复制原点+目的基因插入位点目的基因插入位点+标记基因标记基因基因表达载体的组成：基因表达载体的组成： 复制原点复制原点+目的基因目的基因+标记基因标记基因+启动子启动子+终止子终止子三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞 1 1、什么是转化？、什么是转化？ 2 2、目的基因导入植物细胞常用的方法、目的基

8、因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？是什么？具体过程是怎样的？ 3 3、目的基因导入动物细胞常用的方法、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？是什么？基本操作程序是怎样的？ 4 4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？样的？钙离子有什么作用？转化转化目的基因进入受体细胞内，并且在受目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内体细胞内维持稳定和表达维持稳定和表达的过程。的过程。1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞常用的方法常用的方法: : 农杆菌转化法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉基因枪法、花粉 管通道

9、法管通道法农杆菌的特点农杆菌的特点: :a.a.易感染双子叶植物和祼子植物。易感染双子叶植物和祼子植物。b.b.具有趋化性。具有趋化性。c.tic.ti质粒上的质粒上的t-dnat-dna可转移到受体细胞，可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的dnadna上上1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞农杆菌转化法的导入过程农杆菌转化法的导入过程: :构建基因表达载体构建基因表达载体转入转入农杆菌农杆菌植物细胞植物细胞导入导入稳定维持和表达稳定维持和表达. .目的基因导入动物细胞目的基因导入动物细胞常用的方法常用的方法: : 显微注射技术显微注射技术操作程序：操

10、作程序：a.a.先提纯含目的基因的表达载体先提纯含目的基因的表达载体 b.b.从动物体内取出卵从动物体内取出卵( (受精卵受精卵）c.c.显微注射仪进行显微注射显微注射仪进行显微注射 d.d.将含目的基因的受精卵移植到输卵将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体管或子宫中发育成新个体3.3.目的基因导入微生物细胞目的基因导入微生物细胞原核生物的特点原核生物的特点: :繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。少。大肠杆菌的转化过程大肠杆菌的转化过程: :用用caca2+2+处理细胞处理细胞 增加细胞增加细胞壁壁的透性，的透性，与细胞膜无关与细胞膜无关

11、感受态细胞感受态细胞重组表达载体重组表达载体dnadna分子与感受态细胞混合分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收dnadna分子分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1 1、导入目的基因后需要检测哪些方面？、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？各采取什么方法？2 2、什么是、什么是dnadna分子探针？检测时的分子探针？检测时的dnadna探探针通过什么原理来检测目的基因和相针通过什么原理来检测目的基因和相应的应的mrnamrna？3 3、利用抗体抗原杂交检测的原理是什、利用抗体抗原杂交检测的原理是什么？么？目的基因是否插入受体细胞染色体的目的基因是否插入

12、受体细胞染色体的dnadna上？上？检测检测1 1：检测方法检测方法: :dnadna探针：探针：用放射性同位素等作标记的含有用放射性同位素等作标记的含有目的基因的目的基因的dnadna片段。片段。dnadna分子杂交技术分子杂交技术用用dnadna探针与基因组探针与基因组dnadna杂交。杂交。目的基因是否转录出目的基因是否转录出mrnamrna？检测检测2 2：检测方法检测方法: :分子杂交技术分子杂交技术用用dnadna探针与探针与mrnamrna杂交。杂交。检测检测3 3：检测方法检测方法: :抗原抗原抗体杂交抗体杂交目的基因是否翻译出蛋白质目的基因是否翻译出蛋白质 4 4、个体生物学

13、水平的鉴定、个体生物学水平的鉴定珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分，当它的成分异常时，动物可能患成分，当它的成分异常时，动物可能患某种疾病，如镰刀型细胞贫血症，假如某种疾病，如镰刀型细胞贫血症，假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出鼠的出鼠的珠蛋白，想一想，应该如何珠蛋白，想一想，应该如何设计？设计？ 思考与探究思考与探究1.1.从小鼠中克隆出从小鼠中克隆出珠蛋白基因的编码序列珠蛋白基因的编码序列（cdnacdna）。）。2.2.将将cdnacdna前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。3.3.将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如