第三章 动物细胞培养总论

1、动动 物物 细细 胞胞 培培 养养l无细胞壁l倍增时间长，生长缓慢l需氧量少，对搅拌敏感l聚集体形成l原代细胞培养50代即开始退化l动物的体外培养分为： 细胞培养、组织培养和器官培养。细胞培养、组织培养和器官培养。l1、细胞培养：将动物的某一组织取出， 使其分散成单个细胞，在人工条件下（无菌、适当温度和一定营养条件下）使之存活、生长和增殖的技术。l2、组织培养： 将动物的组织取出，在模拟体内生理环境下，在体外的人工条件下生存和生长， 并维持组织的结构和功能不变的技术。l组织培养与细胞培养的关系 在组织培养过程中，由于现有的培养手段还不能长期维持组织的结构和功能不变，动物细胞往往会从组织中迁移生

2、长出来，在组织周围形成一圈单层贴壁生长细胞，这圈细胞又称为生长晕。 组织培养最终变成细胞培养最终变成细胞培养。l3.器官培养： 培养对象是器官的原基、器官的一部分或整个器官， 放在模拟体内的生理环境的体外，使之存活、生长并保持一定功能的技术。l抑制细胞从器官培养物中迁移出来。抑制细胞的脱分化，维持器官培养物的结构和功能不变，维持细胞的分化状态。l5、组织工程的意义： 应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。l组织工程的基本方法： 是将体外

3、培养的高浓度组织细胞，扩增后吸附于一种生物相容性良好、并可被人体逐步降解吸收的细胞外基质上。该材料可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，使细胞按预制形态的三维支架生长。然后将这种细胞生物材料复合体植入机体病损部位，在生物支架降解吸收过程中，种植的细胞继续增生繁殖，形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。 l1885年， Roux将鸡胚神经板在温暖的生理盐水中培养几个月，首次提出组织培养的概念。l1907年，Harrison 的髓管培养试验，将蛙胚的神经管的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，从细胞中长出轴突这是公认的组织培

4、养的真正开始。l1912年，Carrel 将无菌操作引入组培试验l另外，他将7天的鸡胚心肌组织块包埋培养于血浆和鸡胚提取液，观察到心肌细胞搏动达104天， 并采用更新培养基和将原代细胞传代 的培养措施，从而解决了细胞体外长期生存的营养问题。l1951年，Eagle,研发人工合成的培养基。l1975年，Sato 用激素、生长因子代替血清，开发了成分明确的培养基。l贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。如：人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞。l悬浮生长： 在悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。如血细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞 群体培养（群体培养（mass

5、culturemass culture）：）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞。；克隆培养（克隆培养（clonalclonal culture culture）：）：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。l 一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。 群体培养克隆培养 第二节 组织培养细胞生命期 原代培养期 传代期 衰退期 原代培养期(primary culture) ： 从肌体取得材料（ 细胞，器官或组织）在培养瓶内培养到第一

6、次传代前的这个过程称为原代培养 。又称初代培养。 此期细胞特点： 细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。 初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，呈二倍体核型。 由于与体内细胞相似性大，可用于检测药物 细胞群是异质的，即各细胞的遗传性状互不相同 细胞相互依存性强，克隆形成率低，即细胞独立生存性差。 克隆形成率（Cloning efficiency）:指细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞群（克隆）的百分数。原代培养的方法：1、组织块培养法：将有机体取出的组织， 切成1mm3大小的组织块，进行培养的 方法。 a）、薄层培养法 b)、反转干涸法2、酶解培养法：将组织剪

7、成1mm3大小的组织后， 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶溶液进行进行 消化，进行培养的方法。鱼类细胞组织块原代培养：鱼类细胞组织块原代培养： 鱼类消毒处理鱼类消毒处理取取 材材接接 种种 培培 养养1）、鱼类消毒处理： 将海水煮沸消毒 加入青霉（1000IU/mL）链霉素（终浓度1000g/mL） 将鱼放入浸泡24h.2)、取材： 无菌条件下取鱼的鳃、吻端、鳍、心肝等组织 磷酸缓冲液（PBS）漂洗 剪成1mm3的组织小块。3）、接种和培养： 用培养液漂洗组织小块数次移入培养瓶，静置12min， 翻转培养瓶，将适量培养液加在非细胞生长面，静置培养24h， 轻轻将培养瓶翻转过来，继续培养直到长成细胞单层；

8、或加薄层培养液，24h后补液。n哺乳动物的原代培养：哺乳动物的原代培养：n鼠胚胎制备：n（1）孕鼠的准备:交配后雌鼠阴道出现阴道栓计算 胎龄。n（2）杀死孕鼠：n（3）取胚胎 ： PBS洗涤浸入含有双抗的 培养液n（4）酶解或是组织块法培养n鸟类胚胎的制备鸟类胚胎的制备n（1）受精蛋的准备：38孵卵箱中静置21d, 每日翻动12次n（2）消毒受精蛋n（3）取胚胎：大头朝上，打破大头，小心的撕去气室膜和尿囊绒膜 用镊子夹出胚胎。n（4）浸泡在培养液中备用。l传代培养期： 从一个培养瓶转移到另一个培养瓶去培养的过程。8 在全生命期中此期最长。此期细胞增殖旺盛。8 呈二倍体核型的细胞系，称为二倍体细

9、胞系（Diploid cell line）悬浮培养的细胞悬浮培养的细胞： 离掉旧的培养液，换上新的培养液。贴壁培养的细胞贴壁培养的细胞： 倒掉旧的培养液 用PBS或PE冲洗单层细胞12次（去掉死细胞） 用适量的0.25%的胰酶消化细胞单层，制成单cell溶液，取1/2悬液接种于另一培养瓶， 并补加新的培养液，继续培养。 为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。 当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。否则，需反复传代，就失去二倍体性质。 一般情况下，当传代10-15次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。 8 衰退期： 动物细胞传代到一定时期就丧失生存能力，到达

10、衰退期。8 特点： 此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。 在以上三期任何一点，一般在传代期末，或衰退期初，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（遗传性状发生改变）。 转化的标志之一是细胞可能获得永生性（immortality）或恶生性（malignancy） 图图示示 体体外外培培养养的的种种类类细胞生长曲线的测绘方法：细胞生长曲线的测绘方法： 接种78组细胞；每组至少三瓶，每日抽一组，将培养液倒入带刻度试管中记下毫升量，用胰酶消化细胞至脱壁，再把培养液倒回培养瓶中混匀，制成单细胞悬液，用血球计数板计数；然后根据每天的细胞数绘成生长曲线。细胞固定化培养即包

11、埋培养： 材料：凝胶海藻钙、胶原、交叉胶和琼胶等。 贴壁细胞： 胶原。 非贴壁细胞：海藻钙。 方法：细胞悬液与23的海藻钙混合，通过成滴器滴入50100mmol/L的CaCl2溶液中，约1h后形成许多稳定的内含细胞的多孔珠（ 36mm）用生理盐水洗涤然后将多孔珠放入培养容器中。 回收：加适量EDTA使多孔珠溶解，离心回收 细胞。包埋的优点：1、步骤简单，条件温和2、细胞负荷量大，泄漏少。3、凝胶网络可以保护细胞抵抗机械剪切。包埋的缺点：1、细胞的生长扩散受到限制。2、大分子物质不能渗透凝胶高聚物、胚胚 胎胎 干干 细细 胞胞 培培 养养历史：历史： Evans和Kaufman(1981)首次从

12、小鼠的胚胎中分离得到小鼠ES细胞。后来又分离得到许多其他动物（猪、牛、绵羊、山羊、家兔、水貂、仓鼠以及人）的ES细胞。但以小鼠的ES细胞分离方法最成熟。技术路线：技术路线： 手术切除受精2.5d的小鼠的卵巢，并同时给予外源激素改变母体生殖激素水平，抑制胚胎着床从而获得延迟着床的胚囊。 将其培养于用有丝分裂C处理的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层，从而获得能够在体外增殖并处于未分化状态的早期胚胎ICM(inner cell mass,内细胞团) 将ICM离散开，并培养于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，得到在体外无限增殖、连续传代的多能胚胎干细胞系1、早期胚胎获取及处理方法； 小鼠3.5d囊胚或2.5d桑椹胚

13、（1620细胞） 猪 910d囊胚； 兔 34d囊胚； 牛 67d桑椹胚或78d囊胚； 绵羊 89d囊胚步骤步骤：a)、延缓胚胎着床摘除卵巢或给予外源性激 素。b)、分离ICM人工去除滋养层细胞（消除竞 争性抑制和分化诱导）c)、脱带处理去除透明带（胰酶、透明质酸 酶和机械）d)、离散卵裂球ICM经胰酶消化并辅以机械 方法分散成单个卵裂球，接种 于饲养层上。2、原始生殖细胞的获取小鼠12.5d胎儿生殖嵴大鼠10.5d尿囊中胚层，12.5d背肠系膜和 13.5-14.5d生殖嵴1、饲养层：用丝列霉素C处理细胞单层，阻断细胞有丝分裂后所得到的细胞单层。l作用：促进细胞增殖和抑制细胞分化l常用：原代

14、小鼠胎儿成纤维细胞PMEE, l 小鼠胎儿成纤维细胞系STO、l 子宫上皮细胞UE,l 同源胎儿成纤维细胞HEF2 2、条件培养基：、条件培养基：作用：利用其含有的细胞分泌的生长因子来 刺激ES细胞的增殖和抑制ES细胞的分化。优点：操作简单，消除饲养层细胞干扰，又使ES 细胞免受丝裂霉素C的影响。分化抑制因子分化抑制因子： 白血病抑制因子。胚胎干细胞系的建立与保存： 及 时 换 液； 及 时 传 代； 不 断 冻 存。一、气升式深层培养系统二、微载体培养系统:l 细胞生长环境均一，培养基利用率高，采样重复性好；放大培养容易，占用空间小，劳动强度小。三、微囊培养系统：l 防止污染，细胞密度大，分

15、泌产物量高；产物分离纯化方便。四、大载体培养系统l 海藻酸钠的凝胶大颗粒2.6mm装入培养器通入培养液和混合气体大规模培养，配有先进的监控设备，控制氧气，pH，培养的输入和产物的收获。n五、中空纤维培养系统n有聚砜和丙烯聚合物制成的中空管状纤维，管壁厚约50-75，管壁似海绵，毛细管壁是半透膜。n培养器：n内室：n外室：l一、体外培养细胞的形态l悬浮培养球形l贴壁培养成纤维细胞型l 上皮细胞型l 游走细胞型l 多形细胞型1、成纤维型细胞：形态与体内成纤维细胞相似而得名，细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状，火焰状或旋涡状走行。来

16、源来源：由中胚层间充质组织起源的组织. 如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮生长特点生长特点 排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞胞细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起维样细胞，常有几个伸长的细胞突起. 2 2、上皮型细胞、上皮型细胞： 具有扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连成单层膜。 起源于内、外胚层细胞 如:皮肤表皮及其衍生物消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮等 皆呈上皮型形态皆呈上皮型形态。3 3、游走型细胞、游走型细胞： 本型细胞在支持物上散在生长，一

17、般不连成片。 细胞质经常伸出伪足或突起，成活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则。 此型细胞不稳定，有时亦难和其它型细胞相区别。联接成片后可呈多角形，有时成纤维细胞形态。4 4、多形型细胞、多形型细胞： 除上述三型细胞外，还有一些组织和细胞如神经组织的细胞等，难以确定它们规律的形态，可统称为多形型细胞。培养细胞形态分类的探讨 当细胞处于较好的培养条件时，形态上有相对的稳定性，在一定程度上能反映细胞的起源，正常和异常也能够区分开来，故可作为判断细胞生物学性状的一个指标或依据。n体外细胞培养有很大的可塑性：受到培养条件的影响：培养基，温度，pH，细胞密度，污染状况，培养方式等。n条件改变，细胞形态

18、可有变化 因此由于细胞形态的易变性，在利用形态学指标判定细胞类型和其它一些性状时，应持谨慎态度。培养细胞形态不稳定培养细胞形态不稳定血清血清 Hela 高血清高血清 低血清低血清 成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细胞上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱太酸或太碱 标准标准pH 成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细胞上皮样细胞 细胞密度细胞密度 3T3 低密度低密度 高密度高密度 成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细胞上皮样细胞生长状态改变生长状态改变悬浮或贴附悬浮或贴附 悬浮悬浮 贴附贴附 圆形圆形 成纤维或上皮样成纤维或上皮样 转化与否转化与否 未转化未转化 转化后转化后 成纤维样成纤维样 可

19、成上皮样可成上皮样 Latent PhaseLatent Phase）a.细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。 此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。b. 接着，细胞附着或贴附与底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。 贴附速度与细胞的种类，培养基成分，底物的理化性质有关。 初代培养细胞贴附慢，可长达10-24小时或更长；连续和恶性转化细胞系快，10-30分钟即可贴壁。c. 细胞贴附于支持物上后，经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖。 在潜伏期时细胞可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。 初代培养细胞潜伏期长，约24-96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6-24小时。 潜伏期除与

20、细胞类型有关，还与细胞接种密度，培养基性质有关。 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。 2.2.指数增生期指数增生期(Logarithmic (Logarithmic growth phase) growth phase) 这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。 a.指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数表示。细胞分裂指数(Mitotic Index: MI):细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。分裂相指处于分裂中的细胞。 指数增生期指数增生期体外培养的细胞分裂指数受细胞的种类、培养液成分，PH、培养箱温度等多种因素的

21、影响。 一般细胞分裂指数介于0.1%-0.5%。 初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%-5%b、指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最重要的阶段。C、接触抑制(Contact inhibition)随着培养细胞数量的不断增多，生长空间也渐趋减少，细胞相互接触汇合成片，如培养的是正常的细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制。恶性细胞无接触抑制，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积。 接触抑制可作为区别恶性细胞与正常细胞的标志之一。 指数增生期d.密度抑制(Density Inhibition): 细胞接触汇合成片后，虽发生接

22、触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。 但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，而发生密度抑制，导致细胞分裂停止。 指数增生期3、停滞期(Stagnate phase) 细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进入停滞期。 此时细胞数量持平，故也称平顶期(platean)停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累，pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽

23、进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传一两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。结果反而耽误了时间。 停滞期1.无污染环境培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存条件的首要条件。机体内因为有免疫系统及肝脏等解毒器官，可以抵御病原的侵入，以及将有毒物解毒并排除体外。细胞一旦被置于体外，便失去了防御能力，一旦被污染或自身代谢物积累，可导致细胞死亡。因此在进行培养时，保持细胞生存环境无任何污染，代谢物及时消除等，是维持细胞生存的基本条件。二、培养细胞生存环境条件2.温度 维持细胞增殖生长，必须有适宜的温度。v 人和哺乳动物36.50.5v 鸟类细胞为38.5，一般36

24、.5v 海水鱼类20-25v 对虾：22-31 总的来说，培养细胞对低温的耐受力比对高温强。 43以上1小时，细胞将被杀死。而温度不低于0，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用。3.气体环境和氢离子浓度P气体是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。P氧气参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长，增殖和合成各种所需成分。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它的主要作用在于能维持培养基的pH值。大多数细胞的pH为7.2-7.4。 在封闭营养时，细胞代谢不断释放二氧化碳，pH变酸，需用碱来调整； 在开放培养时，细胞代谢不断释放二氧化碳，能逸出到外界环境中，而溶液变碱，因此我们在开放

25、培养时，需将培养瓶放在含有5%二氧化碳的气体环境中。采用二氧化碳孵育箱。4.体外培养细胞生存所需基本物质 需要糖、氨基酸、维生素、促生长因子（激素类物质，尤其促生长因子）、微量元素、促贴附物质。5.渗透压： 大多数细胞 260-320mosm/kg 对虾 800 mosm /L左右l定义： 指细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、核型、增殖或其他特性的可遗传的变化。 l原因：外源性、自然发生、化学致癌物 l 的诱导定义：是指细胞在体外培养过程中获得了致癌性，当这种细胞接种于适当的动物，可以产生肿瘤。转化种类：倍性转化、肿瘤性转化、恶性转化l生长特性l永生性l贴壁不依赖性l接触抑制丧失l在细胞

26、单层上聚集生长和堆积生长l生长密度抑制降低和高的生长饱和度密度l低血清依赖性l生长因子不依赖性l贴壁率高l倍增时间短遗传特性自然突变率高非整倍体化异倍体化肿瘤特性致瘤性血管生成性蛋白水解酶分泌旺盛侵染性 定义；中末分化的细胞在体外人工环境下，重新获得分裂增殖的能力，有些细胞还会失去其特异分化性质，甚至通过诱导也不能再现。这种现象叫 体外培养的细胞能否发生去分化，重新获得增殖能力，是获得细胞系的关键所在。* 体外细胞培养的目的： 培养出的细胞系发生去 分化，但仍维持 分化功能。 * 已经成功的细胞系： 小鼠骨瘤细胞 产生抗体 大鼠脑垂体瘤细胞分泌生长激素 人类胎盘细胞分泌绒毛膜促性腺激素 1、培

27、养细胞常规检查2、细胞系鉴定1、培养液pHl酚红作为pH指示剂l中性樱桃红色l碱性粉红色l酸性黄色变酸的原因：细胞生长放出CO 2；培 养液营养耗尽，酸性代谢物废物积累。 污染细菌和霉菌。2、细胞健康状况：生长状态良好透明度大、细胞内颗粒少、 没有空泡，胞膜清晰,胞液清晰透明， 悬浮细胞碎片少。生长状态不良胞质中出现空泡、脂滴和 其他颗粒， 细胞之间出现空隙，细胞 形态不规则。3、微生物污染及其排除：A、细菌：、细菌：鉴定 取细胞培养液接种于肉汤或琼脂培养基， 37C培养数日，培养基混浊。 取细胞培养液涂平板，菌落形成结决方法:加510倍常用剂量抗生素，冲击细胞2448h，再转入正常培养基B、

28、真菌、真菌鉴定： 肉眼可见白色、黄色、黑色菌落。 光镜丝状、树枝状、或瘤状菌丝。 酵母菌出芽生殖特性。 C、支原体、支原体鉴定：较难（对细胞作用不明现， 严重时细胞增殖减慢）检测：DNA荧光染色法，支原体培养法（“煎蛋样”菌落） 免疫学方法，PCR等 排除支原体污染的方法：排除支原体污染的方法：a)、抗生素法：卡那霉素、泰乐霉素等b)、特异性抗血清处理c)、高热处理41作用510h,最长18h.d)、巨噬细胞和抗生素联合处理：比例100：1e)、鼠的传代处理：“蚀斑”是病毒污染的早期指示特征。交叉污染的后果： a、 污染的细胞增殖超过被污染细胞细胞系丢失。 b、污染的细胞是细胞系不纯不能用于实

29、验研究。5、化学污染1、形态学分析：、形态学分析：注：注：条件的一致性培养液、培养基质、l 细胞密度、生长条件2、细胞生长情况：、细胞生长情况：lA、分裂指数lB、生长曲线lC、集落或克隆形成率高，生存能力强。lD、细胞表面受体改变恶性细胞高于正 l 常细胞3、染色体分析、染色体分析 是细胞遗传学的基础： 作用： 鉴定细胞系的种属和性别来源。 检测细胞系遗传物质是否稳定。 离体培养的细胞是否转化。 区别异常和正常细胞。4、同工酶分析：、同工酶分析： 定义：是指同一种属中由不同基因位点或同一位 点的复等位基因编码的多肽链所组成的单体、 同聚体或杂聚体。 特点：具有种属特异性、发育特异性及 组织特

30、异性。 意义：鉴定细胞系的种属 作为细胞系细胞特征的指标 鉴定细胞是否恶性转化或区分正常和肿瘤 细胞。 鉴定细胞系在培养过程中有无交叉感染。 常用的：乳酸脱氢酶（LDH）; 6-磷酸葡萄糖脱氢 酶（G6PD）; 嘌呤核苷酸磷酸化酶（NP）5、软琼脂细胞克隆形成分析：、软琼脂细胞克隆形成分析： 是细胞发生转化，失去贴壁依赖型的重要检测指标。 步骤： 1、制备1103个细胞/mL的细胞悬液 2、制备底层琼脂(0.5%) 3、制备接种琼脂(细胞悬液与50的琼脂混合) 静置培养23周，计算细胞克隆数 （每个克隆的细胞数大于25）l细胞表面抗原：LC亚种分类，上皮C与基质C l 区分，N外胚层C与其他胚

31、层C区分。l中间丝蛋白：星形胶质C的胶质原f酸性Pr、肌肉 l 的结Pr等。l特意表达产物：红C的血红Pr、肌肉的肌球Pr和肌l 原Pr等。l标记酶：肝癌C系HTC表达酪氨酸氨基转移酶等。l专一性功能：心肌的收缩功能，NC膜的去极化等l转化特征：永生性转化，染色体倍性转化，形态l 学转化，肿瘤性转化，恶性转化。 细胞DNA含量和组成是最恒定均一的指标。每个细胞DNA含量、RNA/DNA含量之比、 蛋白质/DNA含量之比的测定。原位核酸杂交技术分子标记鉴定1、非玻璃化冻存2、玻璃化冻存l1、原 理l冰晶损伤和溶质损伤：l细胞内冰晶损伤细胞内部结冰而致的细胞损伤，称l溶质损伤因电解质浓度过高而引起

32、的细胞损伤，称细胞内外形成冰晶低于0细胞膜和细胞器损伤电解质 浓度C内结冰C外结冰时间过长细胞膜上脂质受损细胞膜破裂大量水分流入细胞内大量水分流入细胞内 造成细胞死亡造成细胞死亡l缓慢冷冻和快速复苏细胞以及冷冻保护剂的作用l冷冻保护剂:l 渗透性甘油、DMSO、乙二醇、乙酰胺和甲醇。l 非渗透性大分子物质，聚乙烯吡咯酮（PVP）、蔗糖、 l 聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。l渗透性保护剂的作用：l a、降低细胞的冰点；l b、提高细胞膜对水的通透性l c、稀释细胞内外未结冰溶液中电解质的浓 度，从 l 而减少溶质损伤。非玻璃化冻存：非玻璃化冻存： “ 缓慢冻存”、“快速复苏”、“冷冻保护剂” 等措

33、 施来减少冰晶损伤。具体步骤：具体步骤：、缓慢冻存进行阶段性降温。、快速复苏骤然升温，避免水重结晶，减少冰晶损 伤。、冷冻保护剂甘油或DMSO以5的终浓度加到培养 液中。步骤步骤：生长好的C， 冻前24h换液胰Pr酶消化、离心甘油、DMSO21066106细胞/mL 冻存液分装塑料冻存管4放3060min-70冰箱放12d塑料棉花等包裹直接投入液氮使用降温仪：1、从5-30以每分钟13速度降；2、每分钟2030降至-100-1503、放入液氮中l从液氮中取出快速放入3740水浴中l l尽快融冻后接种到培养瓶内，补加培养液l 贴壁后马上换液冻存温度：液氮（-196）较干冰（-79）效果好冷冻速度

34、：缓慢冷冻较快速冷冻对细胞结构影响小溶冻速度：溶冻速度愈快，细胞存活率越高冷冻保护剂：蔗糖对快速冷冻和慢速冷冻都有保护作用 PVP仅对慢速冷冻又保护作用1、原理： 玻璃化是指液态转变为非结晶态（玻璃态）的固化过程。玻璃态固体分子之间的空间排列和液态相比无明显变化。 技术支持只要降温速度足够快，任何液体 都可以进入玻璃化状态。 解决方法： a、寻求容易实现玻璃化并且对细胞 损害较小的溶液 b、设法提高冷冻速度二、玻璃化冻存： 指液态转变为非结晶态玻璃态的固化过程。 “快速冷冻快速冷冻”“缓慢复苏缓慢复苏”“冷冻保护剂冷冻保护剂”步骤：1、“快速冷冻”: 冰浴加预冷冻存液液氮 原理： 胞内水分来不

35、及形成冰晶，或冰晶很少。细胞进入一种人工的完全玻璃化状态，水分子无重排，不产生结构、体积的变化，故不会引起冰晶、溶质损伤。2、“缓慢复苏” 液氮冰浴5分钟。3、冷冻保护剂浓度高，对细胞毒性大，故滴加和弃除时均需冰浴条件下缓慢进行，保证冷冻保护剂有足够时间渗出细胞，避免对细胞损害。冷冻步骤：冷冻步骤：制备冻存液Hanks平衡盐溶液20.5%DMSO（W/V）15.5%乙酰胺（W/V）10丙二醇10聚乙二醇NaOH调pH至7.4制备动物细胞常规方法离心制备冻存动物细胞，置冰浴中添加冻存液缓慢滴加，终浓度为1.1061.5106个细胞/mL 前3min以0.3mL/min; 后5min以0.6mL/

36、min分装入冻存小管混 匀直接投入液氮直接投入液氮复复 苏苏 步步 骤骤：取出冰浴取出冰浴5min转移到大离心管转移到大离心管冰浴冰浴用预冷的用预冷的20的的Hanks平衡也稀释平衡也稀释稀释后低速离心稀释后低速离心稀释过程缓慢缓慢进行： 50mL需65min前10min0.2mL/min; 10min0.5mL/min ； 15min0.75mL/min； 30min1mL/min1、分离同步化细胞2、诱导细胞同步化l1、各期细胞的分离A、离心洗脱法： 原理：C大小、密度和形状不同，其在一定介质中的浮力大小不同，当C浮力与离心力达到平衡后，停留在淘洗室的不同位置。降低离心速度增加液流量，不同

37、细胞先小后大流出来。DNA荧光染色，流式细胞仪测定DNA含量。 难点：特殊离心转头和流式细胞仪B、细胞分类拣选法：原理：荧光染色DNA，用流式细胞仪检测难点：DNA染色时RNA同时被染色。C、梯度沉降法： 根据形状、大小和密度不同的细胞，在密度梯度溶液的沉降速度不同来分离细胞的。* 梯度溶液：含血清或Ficoll的PBS来制备。* 条件：温度越低，溶液黏度越大，沉降效果越好。 操作在4进行2、M期细胞的分离： 细胞特点：从G2期进入M期，胞体逐渐 隆起，成为圆球形，此时细胞与培养基质的黏 附力大为降低，极易脱落。振摇脱落法： 接种2d后，换液，12h后倒掉旧液， 加新培养液摇晃，使M期细胞脱落

38、。胰蛋白酶消化法： （同上）加0.1%冷胰蛋白酶，轻轻 摇晃，离心回收。1、G1/S期细胞的分离：处理方法： 低温处理法、营养饥饿法和DNA合成阻断法 低温处理法： 4处理210h，细胞阻滞在G1期 营养饥饿法： 低血清、异亮AA或精AA培养基，然后恢复正常。 胸腺嘧啶核苷酸阻断法： 胸腺嘧啶进入细胞后，会迅速转换成脱氧胸腺嘧啶核苷三磷酸，而后者可以反馈抑制核苷还原酶的活性，阻止其他脱氧核苷三磷酸的合成，阻抑DNA的合成。2、M期细胞分离： 秋水仙素（0.051g/mL）处理细胞， 使细胞阻滞于M期一、器官培养的基本方法二、器官培养在生物学和医学上的应用1、原则： a、必须给培养物提供充足的营

39、养和氧气，并及时排除代谢废物。l 组织块要小，创面平整 b、抑制细胞从外植块中迁移生长出来l将培养物放置在迁移时细胞难以有力黏附的表面。l用一层薄的琼脂包被培养物l把培养物经常转移到新的表面上表玻璃培养法：血浆和胚胎提取液琼脂凝胶培养法：合成、天然培养基悬浮培养法：外植块悬浮于培养液气液界面上的培养：直接漂浮法、擦镜纸法、 金属格栅法循环培养液培养法：器官灌注培养法：较大的完整器官培养环境：l 血清、胚胎提取液、培养基质团块效应：l 细胞间的相互作用。细胞数量达到一定时可以引起N系统的分化。不同组织间的相互作用：l 如：上皮细胞与间充质细胞接触可以引起分化。l1、器官的形态发生研究l2、器官的

40、发育分化研究l3、胚胎致畸作用的研究l4、器官移植研究l5、肿瘤侵袭研究1、动物细胞的形状主要有哪几类？2、体外培养动物细胞的生长曲线有何特点？ 外植块外植块：为体外培养而切下的一小块组织或者器官。 细胞系：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系 亚系：由原细胞系分离出的与原细胞系不同性状的细胞系。 有限细胞系：传代次数有限的细胞系。 连续细胞系：发生了转化，获得了用生性，可以在体外永久存活下来的细胞系，也成为已建成的细胞系，或永生性细胞系 体外转化： 细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、核型、增殖或其他特性的可遗传的变化 恶性转化： 细胞在体外培养过程中获得了致瘤性，当把这种细胞接种动物时可以产生肿瘤 克隆： 由单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。 细胞株： 通过选择法或克隆形成法，从原代细胞系中获得的具有特殊性质或者特异标记的培养物。 贴壁依赖性： 细胞需贴附在培养基质上才能生长的特性，我们称该细胞具有。 接触抑制： 体外培养细胞汇合接触后，生长和增殖停止的现象 汇合： 培养瓶中贴壁生长的细胞彼此相互接触，从而铺满培养瓶的生长面形成细胞单层的过程 密度抑制： 细胞的数量达到一定的量后抑制生长，该特性被称为V