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1、第一章绪论一、填空题1基因工程是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。基因工程技术的诞生，使人们从简单地利用现存的生物资源进行诸如发酵、酿酒、制醋和酱油等传统的生物技术时代，走向按人们的需要而定向地改造和创造具有新的遗传性品种的时代。2随着基因工程技术的诞生和发展，人类可以通过细菌发酵、 真核细胞培养和乳腺生物反应器等三种主要生产方式，大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究或治病。3 Cohen 等在1973年构建了第一个有功能的重组DNA 分子。4基因工程的两个基本特点是：(1) 分子水平上的操作， (2)细胞水平上的表达。5基因克隆中三个基本要点是：克隆基因的类型；受体的选择和

2、载体的选择。61972年，美国斯坦福大学P Berg等在Proc Natl Acad Sci USA上发表了题为：“将新的遗传信息插入SV40 病毒 DNA的生物化学方法：含有 噬菌体基因和Ecoli 半乳糖操纵子的环状 SV40 DNA ”的论文，标志着基因工程技术的诞生。这一工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。7克隆基因的主要目的有四个：(1)扩增 DNA；(2)获得基因产物； (3)研究基因表达调控；(4)改良生物的遗传性。二、选择题 (单选或多选 )1因研究重组DNA技术而获得诺贝尔奖的科学家是 ( C)(a)A Komberg(b)W Gilb

3、ert(c)P Berg(d)B McClintock2第一个作为重组 DNA载体的质粒是 ( C)(a) pBR322 (b)ColEl(c)pSCl01(d)pUCl83第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是( A)(a)EcoRI(b)EcoB(c)EcoC(d)EcoR 4 P Berg 构建 SV40二聚体时用了几种不同的酶，其中( B)的作用是制造隐蔽的 5端。(a)末端转移酶(b) 外切核酸酶(c)外切酶(d)DNA 连接酶三、简答题1为什么说基因工程技术是60 年代末 70年代初发展起来的 ?答： 这是因为： (1)1967年发现了连接酶；(2) 大肠杆菌的转化技术是1970

4、年获得突破； (3)限制性内切核酸酶的分离始于1970 年； (4)Berg 在 1972 年构建了第一个重组的DNA分子。2重组DNA 的含义是什么?答： 将一个生物的DNA片段插入到一个载体中，并引入到另一生物体中进行繁殖。3如何理解基因工程的两个特点?答：基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表达。分子水平的操作包括DNA 分离、切割和连接(还有其他一些DNA 的修饰等 )。由于体外重组DNA 的最终目的是要改变生物的遗传性，所以分子水平的操作和细胞水平的表达是基因工程的两个最基本的特点。4在 Cohen 构建有生物功能重组体的第一步实验中，用EcoRI切割了R6-5 质粒，

5、然后转化EcoliC600，在卡那霉素抗性子板上筛选到了pSCl02 ，它是由R6-5 的三个EcoRI片段组成，请推测这个质粒具有什么遗传特性 ?答：至少可说明两点：(1)pSC 102 含有复制起点，是一个独立的复制子；(2) 重组 DNA 分子中的卡那霉素抗性基因得到了表达。5什么是动物乳腺生物反应器?答： 够分泌乳汁的转基因动物生产其他来源的基因产品，并通过乳腺分泌出来。四、问答题1 S N Cohen于1973年构建了三个重组体，pSCl02 ，pSCl05 ， pSCl09请说明这三个重组体是如何获得的?各说明了什么?答：pSCl02：用EcoRI切割R6-5，混合转化大肠杆菌，在

6、卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆，并从该克隆中分离了重组质粒 DNA ，命名为 pSCl02 。该质粒是由质粒 R 6-5 的 EcoRI 酶切片段、 V 和在体内连接的，说明可以利用体内连接构建重组体。pSCl05 ：作者分别用EcoRI 切割质粒pSC 101、pSC 102,然后加入DNA 连接酶进行连接后转化大肠杆菌，在四环素和卡那霉素双抗性的平板上筛选到pSC 105。说明用质粒作为载体，体外连接可得到有功能的重组体。pSCl09 ：pSC 101 与 RSF 1010 的共整合，即用 EcoRl 分别切割这两个质粒，然后在体外进行重组。说明两个独立的复制子体外重组后仍具有生物功能。

7、2基因克隆是如何使含有单个基因的DNA 片段得到纯化的?答：大分子量的DNA 会含有许多特殊限制性内切核酸酶的限制位点，因此用一种限制酶处理一完整染色体或整个基因组会产生许多不同的DNA 片段， 每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。当全部片段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时(图 A14.1) ，每个片段将插入一个不同的载体分子(比如一个质粒)，同样地，当用这些质粒转化宿主细胞时，每个宿主细胞将只接收一个质粒DNA 分子而筛选出的含重组质粒的每个菌落实际上会含有某一特异的供体DNA 片段的多个拷贝。一旦带有待研究的特定基因的克隆被确认了，此重组DNA分子可从宿主细胞中提取

8、出来进行纯化。五、概念题1 遗传工程 ：是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想，在离体条件下，对生物细胞、细胞器、染色体或 DNA 分子进行按图施工的遗传操作，以求定向地改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。2 生物技术 ：生物技术又称生物工艺学，生物工程学。是根据生物学、化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分，进而利用生物体所具有的功能元件(如基因、蛋白质) 等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。3 基因工程 ：基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因 (DNA 分

9、子 )，按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种 DNA 分子，然后导人活细胞， 以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。4 细胞工程 ：细胞工程 (cellengineering) 应用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术，以及在体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品，或利用细胞体本身的技术领域。5 细胞分泌工程 ：细胞分泌工程是根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技术，主要是通过对基因改造，如基因缺失、多效分泌突变、周质泄漏突变或拼接信号肽基因等措施，促进基因产物分泌的技术。

10、6酶工程 ：酶工程 (enzymeengineering) 又称为酶技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性，结合现代化的技术手段，在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品；以及利用重组 DNA 技术定向改变酶，进行酶的修饰，或酶的全人工合成。7蛋白质工程 ：蛋白质工程 (protein engmeenng) 是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作，通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非天然蛋白质的技术。8 发酵工程 ：发酵工程 (fermentation engineering) 又称微生物工程，微生物发酵工程。利用生物，主要是微生物的某种特定功能，通过现代化工程技术手段

11、，生产有用物质，或把微生物直接用于某种工业化生产的一种技术体系。9移动基因 ：移动基因 (movable gene)又叫转座元件 (订 ansposable element)。是一类可以在同种 DNA 或异种 DNA 间移动的基因，但这种移动只是移动一个拷贝，在原来的位置仍保留一份拷贝。10 断裂基因 ：断裂基因 (splitgene ， intermptedgene) 是被间隔序列间隔成若干部分，而形成不连续形式的基因，是真核基因的普遍形式。11重叠基因 ：重叠基因 (overlapping gene) 是指一个基因的序列中， 含有另一基因的部分或全部序列。 即一段 DNA 序列中含有合成两

12、个或两个以上的多肽的基因。重叠包括编码区和控制区的重叠。12 假基因 ：假基因 (pseudogene)是一类在基因组中稳定存在，序列组成也酷似正常基因，但不能表现出任何功能的 DNA 序列。它是相应的正常基因突变而丧失活性的结果。第二章限制性内切核酸酶一、填空题1严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease) 是指已被证明是限制修饰系统的一个组成部分的酶。基因工程中把那些具有识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。21952年 Luria 和 Human在 T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现

13、了细菌的限制和修饰现象。3 1970 年， Smith和 Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA ，这个酶后来被命名为Hind ，这是第一个分离到的类限制性内切核酸酶。4通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的限制性酶切图谱。5类限制性内切核酸酶分子量较小一般在2040kDa ，通常由24 个相同的亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA ，极少数类酶也可作用于单链DNA ，或 DNA RNA杂合链。这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也

14、有要求，因此，类酶既具有切割位点专一性，也具有识别位点的专一性，一般在识别序列内切割。 切割的方式有平切和交错切，产生平末端的 DNA 片段或具有突出黏睦末端的 DNA 片段。作用时需要Mg2+作辅助因子，但不需要ATP和SAM。6完全的回文序列具有两个基本的特点，就是： (1)能够在中间划一个对称轴， 两侧的序列两两对称互补配对(2)两条互补链的5 3的序列组成相同，即将一条链旋转180，则两条链重叠。7类限制性内切核酸酶一般识别4 6个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有GC倾向，即它们在识别序列中含量较高。8EcoK

15、是 I 类限制性内切核酸酶，分子组成是 22 ，分子量 300kDa。在这些亚基中，o 亚基具有限制性内切核酸酶的作用作用； 亚基具有甲基化酶的活性； 亚基的作用则是识别DNA。9个体之间 DNA 限制性片段长度的差异叫限制性片段长度多态性(RFLP )。10限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自属名的第一个字母，第二、第三两个字母取自种名的前两个字母，第四个字母则用株名表示。11限制性内切核酸酶Acy I 识别的序列是5 GRCGYG-3 ，其中 R代表 A或者是 T，Y代表G或者 C。12在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2 秒钟，其目的是混合均匀和防止部

16、分酶切。13部分酶切可采取的措施有： (1)减少酶量(2)缩短反应时间(3)增大反应体积等。14第一个分离的限制性内切核酸酶是EcoK；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是EcoRl。15限制性内切核酸酶BsuRI 和 Hae的来源不同， 但识别的序列都是GGCC，它们属于异源同工酶。16由于 DNA 是由4 种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是4n。17Sal I 和 Not I 都是哺乳动物中识别序列稀有的酶，在哺乳动物基因组的5kb 片段中，找到NotI 切点的概率是1 200。18部分酶切是指控制反应条件，使得酶在DNA 序列上的识别位点只有部分得到切割

17、，它的理论依据是酶切速度是不均衡的。19 I 类限制酶识别DNA 的位点和切割的DNA 位点是不同的，切割位点的识别结合有两种模型，一种是限制酶移动，另一种是DNA弯曲。20限制性内切核酸酶通常保存在50浓度的甘油溶液中。二、判断题1限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过对外源 DNA 的修饰和对自身 DNA 的限制实现的。2限制性内切核酸酶在 DNA 中的识别切割位点的二级三级结构也影响酶切效率。一般来说，完全切割质粒或病毒 DNA ，要比切割线状 DNA 需要更多的酶，最高的需要 20 倍。 正确错误3如果限制性内切核酸酶的识别位点位于DNA分子的末端， 那么接近末端的程度也影响切割

18、，如 Hpa和MboI要求识别序列之前至少有一个碱基对存在才能切割。正确4能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌，其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列。错误5限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP) 图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图谱而后者是一个连锁图。正确6用限制性内切核酸酶Hae分别切割载体DNA和供体DNA后，可用Ecoli DNA连接酶进行连接。错误7已知某一内切核酸酶在一环状DNA 上有 3个切点，因此，用此酶切割该环状DNA, 可得到3 个片段。正确8迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链DNA ，又能作用于单链 DNA 。 错误9基因工程中使用的类限制性内

19、切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性。错误10 DNA 多态性就是限制性片段长度多态性。错误11用限制性内切核酸酶PstI 切割质粒 pBR322 后，再用外切核酸酶 Exo 进行系列缺失，可得到一系列大小不同的缺失突变体。错误12甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶的星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在5以下。 正确13具有 EcoR末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoR末端的载体中。正确14从 Esherichiacoli K中分离的限制性内切核酸酶命名为EcoK 。 错误15同一种限制性内切核酸酶切割靶DNA ，

20、得到的片段的两个末端都是相同的。错误16在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他的限制性酶就不能切割了。错误17稀有酶是指那些识别序列很长又不常用的限制性内切核酸酶。错误三、选择题 (单选或多选 )1关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( B) 不太恰当。(a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成(b)这一系统中的核酸酶都是类限制性内切核酸酶(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对(d)不同的宿主系统具有不同的限制修饰系统2 RFLP 产生自 (C)DNA进行修饰(a)使用不同的限制性内切核酸酶(c)染色体中碱基的随机变化(b) 每种类型的染色体有两条

21、(二倍体 )(d)Southern 印迹(e)不同探针的使用3型限制性内切核酸酶：(B)(a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列(b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供(c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性(e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供4型限制性内切核酸酶：( C)(a)由两个亚基组成，仅识别半甲基化位点。甲基化位点相对于限制位点的位置(上游或下游)决定了DNA是被甲基化还是被限制(b) 不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥：MS 亚基促使甲基化，R 亚基促使限制(c) 由两个亚基组成，在识别位点附近识别并进行

22、甲基化或限制(d) 在错配修复中起关键作用，因为酶结合到DNA 上是以结构扭曲为基础而不是序列错误识别(e)是光依赖型酶，是嘧啶二聚体进行“光反应”的关键酶，它们能使胸腺嘧啶二聚体间的共价键断裂5分析限制性内切核酸酶切割双链DNA 所得到的DNA 片段的长度有助于物理作图，这是因为：( C)(a)即使只用一种限制酶，因为DNA 是线性的，所以也可以迅速确定限制性片段序列(b)内切酶在等距离位点切割DNA ，同时对于每个生物体的长度是特异的(c)DNA的线性意味着单限制性酶切片段的长度之和等于DNA的总长，而双酶切产生的重叠片段则产生模糊的图谱(d)这些内切酶的消化活性是物种特异的(e)这一技术

23、同时为核苷酸序列提供了广泛信息6通过限制性片段分析，可以对等位基因进行精确的分析比较，其原因是：(BD)(a)限制性内切核酸酶只切割两个变异等位基因中的一个(b)它利用限制性位点作为遗传标记(c)一个特定细胞中等位基因的核苷酸序列不会是相同的(d)它不依赖于变异等位基因产物的功能。(e)限制性内切核酸酶的切点被限制在DNA的编码区域内7限制性片段长度多态性(RFLP) 是： ( C)(a)用于遗传的“指纹结构”模式分析的技术(b)二倍体细胞中的两个等位基因限制性图谱的差别(c)物种中的两个个体限制性图谱间的差别(d)两种物种个体间的限制性图谱差别(e)两种酶在单个染色体上限制性图谱的差别8为了

24、正确地构建一个真核基因组的物理图谱：(AE)。(a)必须有可能清晰地分离各个染色体(通过脉冲场凝胶电泳)(b)必须从单倍体细胞(配子 )中分离DNA ，这样避免了由二倍体细胞中同源染色体的存在而产生的干扰信息(c)必须进行单个染色体分析，这只能在细胞分裂后期进行(d)必须找到对于每个染色体只切割一次的限制酶(e)必须首先分离核 DNA和细胞器DNA ，然后对它们分别作图9下面有关限制酶的叙述哪些是正确的?(BCDE)(a)限制酶是外切酶而不是内切酶(b)限制酶在特异序列(识别位点 )对 DNA 进行切割(c)同一种限制酶切割DNA 时留下的末端序列总是相同的(d)一些限制酶在识别位点内稍有不同

25、的点切割双链DNA ，产生黏末端(e)一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA ，产生平末端10因研究 噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( B)(a) J Lederberg (b) WArber(c) H Smith(d) FSanger11第一个被分离的类酶是：(C)(a)EcoK(b)Hind (c)Hind (d)EcoB12双链 DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列，这种序列一般具有下列特征：(ABC)(a)有对称轴(b)两条链的 5 3方向的序列相同(c)是类酶的识别序列(d) 可增强基因的表达13在下列进行DNA 部分酶切的条件中，控制那一项最好?

26、( B)(a)反应时间(b) 酶量(c)反应体积(d) 酶反应的温度14在下列试剂中，那一种可以螯合Ca 2离子 ?(D)(a)EDTA(b)柠檬酸钠(c)SDS(d)EGTA，15在下列工具酶中，那一种可以被EGTA 抑制活性 ?(D )(a)S1 单链核酸酶(b)末端转移酶(c) 碱性磷酸酶(d)Bal 31核酸酶16限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( B)(a)双链 DNA 的特定碱基对(b)双链 DNA 的特定碱基序列(c)特定的三联密码(d) 以上都正确17在下列酶中，催化反应不需要ATP的是(D)(a)EcoK(b)EcoB(c)T4DNA连接酶(d)BamHl18下列关于限制性

27、内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是( D)。(a)Sau3AI(b)E coRI(c)hindIII(d)Sau 3A119限制性内切核酸酶的星号活性是指：(A)(a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。(b)活性大大提高(c)切割速度大大加快(d)识别序列与原来的完全不同20下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?(D )(a)甘油含量过高(b)反应体系中含有有机溶剂(c)含有非 Mg 2 的二价阳离子(d)酶切反应时酶浓度过低21 DNA 被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，那一项不太可能?(A)(a)酶失活(b)蛋白质 (如 BSA) 同 DNA 结合(c)酶

28、切条件不合适(d)有外切核酸酶污染22关于回文序列，下列各项中，(D)是不正确的(a)是限制性内切核酸酶的识别序列(b) 是某些蛋白的识别序列(c)是基因的旁侧序列(d) 是高度重复序列23关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( B )不太恰当(a)由作用于同一DNA 序列的两种酶构成(b)这一系统中的核酸酶都是类限制性内切核酸酶(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA 进行修饰(d)不同的宿主系统具有不同的限制修饰系统四、简答题1现分离到 X82 噬菌体的一个突变型，它同野生型的噬菌斑相当不同，并已分离到这两种噬菌体的DNA ，请设计一个实验，初步鉴定是点突变、插入突

29、变还是缺失突变?答： 用 RFLP 分析法，即限制性酶切片段长度多态性。1.用不同种限制性内切酶处理两种噬菌体的DNA ；2.将产生的 DNA 的片段进行琼脂糖凝胶电泳；3.比较电泳条带片段差异。2说明 SangerDNA测序法的原理。答： SangerDNA 测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5端向 3端聚合 (DNA 聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程 )； (2) 可延伸的引物必须能提供游离的3，羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3，羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得 4 组长度不同的DNA 片段。通过

30、比较所有DNA 片段的长度可以得知核苷酸的序列。3在酶切反应缓冲液中加入BSA 的目的是什么 ?机理是什么 ?答： 目的是保护酶活性，机理是通过提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活。4 Fredrick 和 McClarin 等用一个由13 个碱基对的 DNA 片段与 EcoRI 、反应，然后分离到酶和DNA共结晶的复合物，通过X 射线分析发现了什么 ?答： 发现：具有活性的EcoRI 是一个二聚体，它们同DNA 结合形成一个直径为50A的球形结构，两个EcoRI位于 DNA 的两侧。5有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。你认为噬菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主

31、的限制作用 ?答：某些噬菌体的基因组中有修饰的碱基，因此对限制性内切核酸酶具有免疫作用。另一种避免限制酶切割的途径是抑制 SAMase 的活性，该酶制造S腺苷甲硫氨酸。某些限制酶作用时需要S腺苷甲硫氨酸。然而，噬菌体在发育过程中不能同某些单碳的供体反应。6某学生在用 EcoRI 切割外源DNA 片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因?答： 盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。7在序列 5 CGAACATATGGAGT-3中含有一个 6bp 的类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么 ?答： 回文序列是： 5 -CATATG-3 8下面几种序列中你认为哪一个(哪些 )最有可能是

32、类酶的识别序列：GAATCG ， AAATTT ，GATATC ，ACGGCA? 为什么 ?答： GATATC； AAATUF ，因为它们是回文序列。9用连接酶将 Sau 3AI(,bGATC)切割的 DNA 与经 BamHI(G GATCC) 切割的 DNA 连接起来后，能够被BamHI 切割的机率有多大 (用百分比表示 )?答： 25 。10用 Klenow 酶填补的办法可使5黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA 上的某些限制酶的识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失?BamH I(G GATCC) ；Taq I(T CGA) ， BssH (G

33、 CGCGC) 。答： BssH不会。11请推测细菌的染色体上是否会有编码识别8 个碱基的内切酶 ? 怎样验证 ?答： 关于这个问题没有明确的答案。这些酶的作用不仅仅限于噬菌体的感染，因为大多数噬菌体并不含有8 个碱基序列的酶切位点，一种可能是8 个碱基的酶是质粒整合后加上去的，作为质粒附加系统的一部分。12当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么 ?答：注意星活性，先低盐， 后高盐； 先低温酶， 后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。五、问答题1什么是细菌的限制修饰系统(restriction-

34、modificationsystem， R-Msystem)答： 细菌中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一DNA 的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。2细菌的限制修饰系统有什么意义?答：不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将 DNA 中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA 上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。由于外来的 DNA在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将人侵的外来DNA

35、 分子降解掉。所以DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。3说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名 +株名的各一个首字母，再加上序号。基本原则：3 4个字母组成，方式是：属名+种名 +株名 +序号；首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写；第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写；(2)若种名有词头，且已命名过限制酶坝， j 取词头后的第一字母代替。第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I 、 ,

36、等，用正体。4 I 类限制酶具有哪些特点?在基因工程中有什么作用 ?答： I 类限制性内切核酸酶的分子量较大，一般在30 万道尔顿以上，通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性内切核酸酶 EcoB是由 R(135kDa) ， M(62kDa) 和 S(55kDa) 三种亚基组成的复合酶，这三个亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为449kDa ，共 5 个亚基，其中 R 亚基和 M亚基各两分子。I 类酶不仅是一种内切核酸酶，同时在酶分子上还具有甲基化酶和ATPase 的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类。作用时除了需要Mg2+ 作辅助因子外，还要求ATP 和S腺苷甲硫氨酸 (SAM) 的存

37、在。 I 类酶具有特异的识别序列，大约15 个碱基对。 I 类酶虽然能够在一定序列上识别DNA 分子，并能同DNA 分子作用，因其识别 DNA 后，要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为 1000个碱基左右 )，并且要形成一个环才能切割DNA ，所以识别位点和切割位点不一致，产生的片段较大。因此在基因工程中作用不大。5类限制酶有哪些特点?答： 类酶是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于I 类酶，作用方式基本同类酶。如EcoPI 是由两个亚基组成，一个亚基(M亚基 )负责位点识别和修饰，另一个亚基(R 亚基 ) 具有核酸酶的活性。切割DNA 时需要 ATP 、 Mg 2+ ，也能被S

38、AM 激活，但并非必须。6何谓限制性内切核酸酶的切割频率?答： 切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测的切点数。 由于 DNA 是由 4种类型的单核苷酸组成，假定 DNA 的碱基组成是均一的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那么对于任何一种限制酶的切割频率，理论上应为1 4n，n 表示该限制酶识别的碱基数。如识别4 个碱基的限制酶，其切割频率应为每256 个碱基有一个识别序列和切点(1 44 =1 256)，识别 5 个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1024个碱基有一个识别序列和切点，余类推。7什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响 ?答： 类限制酶虽然

39、识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1) 高甘油含量5， v v)； (2) 限制性内切核酸酶用量过高(100U g DNA) ；(3)低离子强度 (25 mmol L) ；(4)高 pH(8.0 以上 )； (5) 含有有机溶剂，如DMSO ，乙醇等； (6) 有非2+的二价阳离子存在(如 Mn2+2+2+2+M

40、g， Cu， C0， Zn等 )。8双酶消化法 (doubledigests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理。答：双酶消化法是绘制DNA中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法。做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消化DNA 分子的基础上，然后再用这两个酶同时或先后消化此DNA ，根据它们的结果，构建物理图谱。9什么是 DNA 多态性 (DNApolymorphism)?答：在正常人群中，各个体DNA 分子的某些位点可以发生中性改变，这些改变虽然会使DNA一级结构产生一定变化，但不影响基因的表达，如果这种中性突变在人群中的频率不低于1，这一现象被称为多态性。DNA 多态性本质上是染色体

41、DNA 中核苷酸数目或排列序的个体差异，这些差异多数为中性突变，不引起表型改变。10限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism ， RFLP) 。当 DNA序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组 DNA 经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时，DNA多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。11计算下列三种酶各自在某染色体DNA序列上识别位点间的平

42、均距离：Alu I ：5 AGCT 3 ”，EcoR I ：5GAATTC33TCGA53 CTTAGG 5Acy I：5GPuCGPyC 3 3CPyGCPuG 5(注：Py 二任何一种嘧啶：Pu 二任何一种嘌吟)答：12在细菌质粒 pBPI 的四环素抗性基因tet R 的中间有一个 Hind 的切点。 用Hind 切割果蝇基因组 DNA ，以 pBPl 为载体构建基因组文库。分子杂交证明克隆15 带有果蝇的目的基因。用Hind 和 EcoRV 对克隆 15进行了酶切分析，电泳结果如图15 1(用酶切的pBPl 质粒 DNA 作对照 )，旁边标出了片段的大小。图 151酶切电泳图谱1 2：H

43、ind 切割；3 4：EcoRV切割； 5 6：HindIII+EcoRV； 1、3、5是质粒DNA ；2、4、6 是15 号克隆。(1)绘制含有插入片段和不含插入片段时的pBPl 的限制性图谱，并标明四环素抗性基因的位置；(2)如果用克隆在另一个与pBPl 完全不同源载体上的四环素抗性基因作为探针进行Southern印迹杂交，预测上述电泳图会出现什么样的杂交带?(3)如果用克隆15 的果蝇DNA片段作为探针进行Southern印迹杂交，放射自显影的结果又是如何?答：(1) 酶切图谱示于图 A15.1图A15.1限制性图谱(2)除No.2的 2.5kb， No.6的1.5kb和1.0kb没有带

44、外，其他都有带。(3)(2) 项中没有带的都有带，有带的都没有带。13为什么大多数内切酶被称为“限制”酶。答： 大多数内切核酸酶是限制性的内切核酸酶，只在特定的位点(即一段特定的核酸序列或甲基化核苷酸)作用。 另外，限制性内切核酸酶主要是用来切割外源片段(例如侵染的噬菌体DNA) 。噬菌体对宿主具有专一性，因为在其他生物中，其DNA会成为细胞限制系统攻击的对象。从这种意义上说是内切核酸酶限制了噬菌体的宿主范围。14据Science 杂志报道：一种重要的遗传疾病可由导致DNA中碱基替换的诱变剂在体外进行人工诱导。设计一种快速用以鉴定疾病基因型的检测方法。答： 这要求基因座已被作图，其目的在于分离基因，测定核苷酸序列以及确定是否碱基替换突变。碱基替换突变可以改变 DNA 修饰酶 (例如甲基化酶、限制酶 )的识别序列。15为了绘制长为 3 0kb BamH