共聚焦激光扫描荧光显微镜 简介以及原理

1、共聚焦激光扫描荧光显微镜 什么是什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？共聚焦激光扫描荧光显微镜？ 共聚焦激光扫描荧光显微镜共聚焦激光扫描荧光显微镜 （LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ） 以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技 术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显 微镜系统微镜系统 共聚焦系统 细胞CT 荧光和荧光显微镜 一、荧光的基础术语 荧光物质： 某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出 波长比照射光长的光线 荧光。受激发

2、后能产生 荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸 收波峰(最大吸收波长) 488nm 520nm 异硫氰酸荧光素(FITC) 发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长) 荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体） 自发荧光(AUTOFLUORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光自发荧光。 漂白(BLEACH)： 荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 漂白。 二、荧

3、光显微镜术的基本原理 荧光显微镜 激发滤镜：激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。从光源中分滤出一定波长范围的激发光。 带通滤色镜带通滤色镜( (BP)BP)：有宽、窄带之分。如：有宽、窄带之分。如：BP450-490BP450-490 长、短通滤色镜组合长、短通滤色镜组合（LP LP + + KPKP）：）：LP450 + KP490LP450 + KP490 双色镜：双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：阻断滤镜：多为长通滤色镜；多为长通滤色镜；LP490LP490 紫外 蓝 绿 高 压 汞 灯 被荧光 探针染 色的生 物样本

4、激发 被标记 结构的 荧光光 学图像 光学 成像 滤镜 分光 488nm 520nm FITC 450nm 490nm 荧光显微镜的不足: 1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多 重荧光的同时采集及共定位。 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度荧光强度不够。 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度 重叠 7.只能在二维环境下观察。 8.样品不能太厚。 9.荧光的串绕无法回避。 10.放大倍率小。 共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置 Laser and

5、electronic Control Unit 激光光源及 控制装置 Computer 计算机 Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置 Microscope荧 光显微镜 Anti-vibration table 防震台 Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System Nikon的 Eclipse C1 Plus 1.性能卓越的平场复消色差TIRF物镜（ 60 x ， 100 x）， NA = 1.49.。这是当前数值孔径最 高的油浸物镜 2.四孔位针孔转盘：用电脑控制针孔的大小， 可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。

6、 3.时间间隔可变的Time Lapse: 可以在拍摄过 程中不同的时间段采用不同的时间间隔。 一、基本组成 （一）激光器激光器:多线氩离子(458 nm, 488 nm, 514 nm) 、 氦氖绿(543nm)、氦氖红(633 nm) （二）扫描器扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单 色器及检测器) （三）光学装置：光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及 分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT） 的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采 集各种荧光信号。 （四）计算机图像存储与处理及控制系统：计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像 的优化、三维重建，实

7、现了全自动程序化控制采集（检 测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中 多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。 一一.分辨率分辨率（0.1 8m） 二二.可可重构样品的重构样品的三维结构三维结构 三三.无无损伤、连续光学损伤、连续光学切片切片 四四.光谱扫描光谱扫描 （分辨由光源波长，物镜参数和针孔直径等 决定，如60X，NA1.4的物镜水平分辨率约为 0.2 m，垂直分辨率约为0.5m。） （细菌细胞1-2 m，原核生物细胞1-10 m） 利用照明针孔和探测针孔实现点照明和探 测，并且被探测点位于焦平面。照明针孔 与探测针孔对被照射点或被探测点来说是 共轭的，因此被探测点即

8、共焦点。 1.点照明（为作图方便已将光线发散角放大） 假设是场照明（非共聚焦），会导致： 一.发生衍射，使像模糊； 二.散射光干扰（即除了成像点外，其余 点处有散射光进入探测针孔）； 而点照明则不会有这些问题。 消除衍射影响消除衍射影响消除背景杂光消除背景杂光 2.焦平面点成像 焦平面上的像是最清晰的，从上面的图可 以看出，非焦平面点所成 的像的光像被探 测针孔挡住，不会进入光探头，所以焦平 面点成像使像更清晰。 所以共聚焦成像方式可以很大的所以共聚焦成像方式可以很大的 提高分辨率和成像质量。提高分辨率和成像质量。 一. XY轴扫描 二. Z轴扫描 （1）单光束扫描模式 其中最常见的扫描安排结

9、合了两个独立的 扫描镜，具有中继光学系统。移动的垂直 轴的反射镜即在试样上产生XY平面的扫 描。但中间需要增加高级别的像差校正光 学系统，导致发光效率降低。 （1）单光束扫描模式 （2）多光束扫描（尼普可夫圆盘扫描） 多光束扫描技术提供了一个替代的单光束扫描 配置照明效率低，而且扫描速度更快。其中旋 转盘扫描仪有数百个孔，其功能作为照明和探 测的针孔。由于磁盘扫描显微镜形成的实像， 可以直接位于CCD照相机的图像平面中。尽管 这方面的优势，它允许实时聚焦和成像的动态 过程，有几个缺点限制了磁盘扫描共聚焦系统 的实际效用。其中最严重的是典型的依赖于传 统的广谱光源，和在磁盘发生极端的光损失。 （2）多光束扫描 奥林巴斯Fluo View300 激光共聚焦扫描系统 光电倍增器 双色镜 激发和 发射滤 波滑动 器 强度调整密度塔 激发发 射和射 柱准直 仪 电源 X-Y检流计镜扫描 控制器 出入口透 镜系统 同样可以实现 XZ轴，YZ轴扫描 通常的方法是通过计算机控制的马达以预 先设定的步距移动显微镜的镜台然后采集 图像。 （当然也有通过改变焦平面位置的方法） 通过精细平面光切，形成生物样品不同平通过精细平面光切，形成生物样品不同平 面的精细图象，将一个连续的光切图象面的精细图象，将一个连续