第三章第一节第二节、生物化学检验常用技术

1、第三章第三章 生物化学检验常用技术生物化学检验常用技术光谱分析技光谱分析技电化学分析技术电化学分析技术干化学分析技术干化学分析技术电泳分析技术电泳分析技术基因扩增技术基因扩增技术第一节第一节 光谱分析技术光谱分析技术吸收光谱分析技术吸收光谱分析技术发射光谱分析技术发射光谱分析技术散射光谱分析技术散射光谱分析技术一、吸收光谱分析法一、吸收光谱分析法4微粒性微粒性(E=h(E=hv v) ) 波粒二象性波粒二象性波动性波动性( ( =c/=c/v v) )E=hE=hv v =hc/ =hc/ E=hv是电子能量公式，其中是电子能量公式，其中h是是普朗克常量普朗克常量，v是电子频率，普朗是电子频率

2、，普朗克常数记为克常数记为 h ，是一个物理常数，用以描述量子大小。普朗克常，是一个物理常数，用以描述量子大小。普朗克常数的值约为：数的值约为：6.62619610-34Js光光的能量与光的波长成反比，与光的频率成正比的能量与光的波长成反比，与光的频率成正比光是高速光是高速传播的电磁波传播的电磁波5海水为什么是蓝色的？67能量转移理：理： 当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子（原子）与光子发生“碰撞”，光子的能量因此转移至分子（原子）上，使它们由基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)，这种跃迁称为激发。8能量释放能量释放 处于较高能态的分子(激发态分子)不稳定，当其返回基态时，以热或发射光谱

3、的形式将能量释放出来。所发射出的相应光谱，称分子发射光谱。9E1E0吸收光谱发射光谱激发态基态E1 E010( (二二) )、光吸收定律、光吸收定律1 1、吸光度、吸光度与透光度与透光度 A A = -lgT = - = -lgT = -lgIlgIt t/I/I0 0 = = lgIlgI0 0/I/It t 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一一部分光部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I I0 0，透射光强度为透射光强度为I I，I I和和I I

4、0 0之比称为透光度之比称为透光度，即：即：T = T = I It t/I/I0 0 T T常用百分数表示，称为常用百分数表示，称为百分百分透光率。透光率。透光度的负对数称为透光度的负对数称为吸光度吸光度即：即：入射光入射光 I I0 0透射光透射光 I It t112 2、Lambert-BeerLambert-Beer定律定律Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础分光分析的理论基础。 A = KLCA A 为为吸光度吸光度；K K 为为比例常数，称为吸光系数比例常数，称为吸光系数；L L 为溶液层为溶液层厚度，称为

5、光径厚度，称为光径；C C 为为溶液浓度溶液浓度 Lambert-BeerLambert-Beer定律适用于定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体液体当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层厚度和溶液浓度成正比。厚度和溶液浓度成正比。L LA = KLC摩尔吸光系数 摩尔吸光系数：其意义是1摩尔浓度的溶液，在光径1cm时对某波长光束的吸光度。当溶液层厚度单位为cm，浓度单位为mol/L时，K即成为摩尔吸光系数。 NADH在260nm时， 260nm=15000 ， NADH在34

6、0nm时， 340nm=6220。14NADHNADHLambert-Beer定律定律适用于适用于: :可见光可见光、紫外光、红外光和均匀非散射、紫外光、红外光和均匀非散射的的液体以及分散均匀的固态或气态样品液体以及分散均匀的固态或气态样品. .单色光单色光 均匀介质均匀介质吸收物质无相吸收物质无相互作用互作用3 3、Lambert-BeerLambert-Beer定律的应用条件定律的应用条件4 4、Lambert-BeerLambert-Beer定律的偏离现象定律的偏离现象溶液：稀溶液、化学变化溶液：稀溶液、化学变化光学光学; ; 非单色光、散射和折射非单色光、散射和折射仪器仪器; ; 光源

7、、实验条件光源、实验条件5 5、Lambert-BeerLambert-Beer定律的应用定律的应用170.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示器显示器钨灯、卤钨灯 3501000氢灯、氘灯 180360滤光片棱镜光栅玻璃比色皿石英比色皿 （三）分光光度计的基本结构18光源单色器样品室检测器显示1. 光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在35

8、03502500 nm2500 nm。 紫外区：氢、氘灯。发射紫外区：氢、氘灯。发射185185400 nm400 nm的连续光谱。的连续光谱。192.单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统波长单色光的光学系统。包括滤光片、棱镜和光栅等。包括滤光片、棱镜和光栅等。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器；入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； 聚

9、焦装置：透镜或聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝； 出射狭缝。出射狭缝。203. 比色杯 样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4. 检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5. 显示器 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理21 可见分光光度计22 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计23 Beckman 紫外紫外-可见可见分光光度计分光光度计eppendorf 紫外

10、紫外-可见可见分光光度计分光光度计24使 用 图 示1.开启电源，指示灯亮，仪器预热10分钟，选择开关置于“T” 。2.打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0%T”旋钮，使数字显示为“00.0”。 253.将装有溶液的比色皿放置比色架中。 4.旋动波长手轮，把测试所需的波长调节至刻度线处。 26 5.盖上样品室盖，将参比溶液比色皿置于光路，调节透过率“100%T”旋钮，使数字显示为“100.0T”（如果显示不到100%T，则可适当增加灵敏度的档数，同时应重复“2”，调整仪器的“00.0”）。276.将参比溶液比色皿置于光路中，将选择开关置于A，旋动吸光度调零旋钮，使得数字显示为.000，然后移

11、入被测溶液，显示值即为试样的吸光度A值。 287全部测定结束后，取出比色皿(洗净)，关闭开关.29分光光度计的类型分光光度计的类型1.单光束 简单简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。的稳定性。2.双光束 自动记录，快速全波自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价结构分析。仪器复杂，价格较高。格较高。30

12、3.双波长 将不同波长的两束单色光将不同波长的两束单色光( (1 1、2 2) ) 快束交替通过同快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。 = =1 12nm2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。两波长同时扫描即可获得导数光谱。31(1).(1).标准曲线法标准曲线法 根据根据Lambert-BeerLambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法（

13、浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标为横座标，以吸光度为纵座标，将，将对应各点连成一条通对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为过原点的直线，这条直线称为标准曲线标准曲线。待测溶液测定。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。u方法：四、分光光度法在生化检验中的应用四、分光光度法在生化检验中的应用5.5.标准溶液设置的浓度范围足够大。标准溶液设置的浓度范围足够大。332 2比较法比较法 C CR R=(A

14、=(AR R C Cs s)/A)/As s 己己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时，同时测测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品标准品浓度，可直接浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：计算出标本的浓度，计算公式为： 火焰光度法是以火焰为能源使金属元素激发后发射出特火焰光度法是以火焰为能源使金属元素激发后发射出特征谱线的特点进行检测的分析方法。征谱线的特点进行检测的分析方法。 它是一种简化的发射光谱分析法。它是一种简化的发射光谱分析法。五、火焰光度分析法五、火焰光度分析法F

15、P640火焰光度计火焰光度法分析示意图火焰火焰光度法的特点光度法的特点应用范围窄灵敏快速准确设备简单试样溶液于数分钟内可完成测定火焰光源稳定性高，干扰少，误差为25，可用于微量分析和常量分析分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达0110106 g被测试样易被火焰激发，产生的谱线较简单，且均在可见光区，故使谱线分离和测量的设备简单主要用于钾、钠离子定量分析1.共存元素的干扰：共存元素、阴离子、阳离子的干扰2.火焰对测定的影响：火焰的纯度和燃烧状态的稳定性3.标准品的影响：成分复杂，相互影响影响火焰光度分析的因素六、散射光谱分析法六、散射光谱分析法透射比浊与散射比浊是免疫比浊的常见的两种方法，其反应

16、的原理一样，只是检测的光信号与仪器的检测器有区别。1、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。2、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。光的散射用单色光照射透明溶液时，大部分按原来方向透射，而一小部分则按不同的角度散射开来。散射光谱分析法利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量分析的方法。38七、原子吸收分光光度法七、原子吸收分光光度法39八、荧光八、荧光光度法光度法NanoDrop ND-3300 Fluoro

17、spectrometer 第二节第二节 电化学分析技术电化学分析技术40n电化学分析方法基本原理电化学分析方法基本原理n离子选择电极分类离子选择电极分类n离子选择电极的分析方法离子选择电极的分析方法 电化学分析方法电化学分析方法 电化学分析是利用物质的电化学性质，测电化学分析是利用物质的电化学性质，测定化学电池电位、电流或电量的变化进行定化学电池电位、电流或电量的变化进行分析的方法。分析的方法。41电位分析法：测定原电池电动势以求物质含量的分析方法电位分析法：测定原电池电动势以求物质含量的分析方法电导法：通过电阻测定以求物质含量的分析方法电导法：通过电阻测定以求物质含量的分析方法电容量分析法：

18、借助某些物理量的突变作为分析重点的指示电容量分析法：借助某些物理量的突变作为分析重点的指示一、电化学分析方法基本原理一、电化学分析方法基本原理l电位分析法是利用电极电位和浓度之间的电位分析法是利用电极电位和浓度之间的关系来确定物质含量的分析方法。关系来确定物质含量的分析方法。42l原电池是利用两原电池是利用两个电极之间金属个电极之间金属性的不同性的不同,产生电产生电势差势差,从而使电子从而使电子的流动的流动,产生电流产生电流.又称非蓄电池，又称非蓄电池，是电化电池的一是电化电池的一种。种。电极电位电极电位电极电位测量电极电位测量在电位分析中，构成电池的在电位分析中，构成电池的两个电极，其中一个

19、，其电两个电极，其中一个，其电位值随待测离子浓位值随待测离子浓( (活活) )度的度的变化而变化，能指示待测离变化而变化，能指示待测离子的浓子的浓( (活活) )度，称为度，称为指示电指示电极极，或，或离子选择性电极离子选择性电极。指示电极指示电极而另一个电极，其电而另一个电极，其电位不受试液组成变化的位不受试液组成变化的影响，具有较恒定的数影响，具有较恒定的数值，只是作为测量电位值，只是作为测量电位的标准，称为参比电极的标准，称为参比电极( (参考电极参考电极) )。 参比电极参比电极离子选择性电极：电位法测定溶液中某种定离子活度的指示电极；离子选择性电极：电位法测定溶液中某种定离子活度的指

20、示电极；能在多种离子存在的混合液中，选择性地响应该特定离子，指示出能在多种离子存在的混合液中，选择性地响应该特定离子，指示出这种离子活度变化情况，测定离子的活度或浓度。这种离子活度变化情况，测定离子的活度或浓度。离子选择性离子选择性电极（电极（ISEISE）45定义：离子选择性电极是一种以电位法测定某些特定离子活度的指示电极。 特点：电极的关键部件敏感膜对溶液中特定离子有选择性响应。敏感膜并不给出或得到电子，而是选择性地让某些离子渗透，同时包含离子交换过程测定原理：基于内部溶液与外部溶液之间产生的电位差，即膜内外被测离子活度的不同而产生电位差，称之为膜电位。 离子选择性电极的类型和品种很多，外

21、形也差异很大；但基本结构都包括：对特定离子有选择性响应的薄膜(敏感膜或传感膜)、内参比溶液与内参比电极。 敏感膜将内侧参比溶液与外侧的待测离子溶液分开，是电极的关键部位。 ISE基本基本结构结构内参比电极内参比电极电极壳体电极壳体内参比溶液内参比溶液敏感膜敏感膜离子选择性电极离子选择性电极结构示意图结构示意图 选择性好选择性好 在多数情况下，共存的离子干扰小，对组成复杂的试样往往在多数情况下，共存的离子干扰小，对组成复杂的试样往往不需要分离处理就可直接测定。不需要分离处理就可直接测定。 灵敏度高灵敏度高 电位法的检出限为电位法的检出限为1010-5-51010-8 -8 mol/Lmol/L，

22、适于微量组分的测，适于微量组分的测定，电位滴定法适于常量分析。定，电位滴定法适于常量分析。 快速快速 仪器设备简单、操作方便、分析快速、测定范围宽、不破坏试液，仪器设备简单、操作方便、分析快速、测定范围宽、不破坏试液，易于实现分析自动化。易于实现分析自动化。 不破坏标本不破坏标本 对有色、浑浊标本均可检测对有色、浑浊标本均可检测。电位电位分析法的特点：分析法的特点： 根据国际纯粹及应用化学联合会根据国际纯粹及应用化学联合会( (IUPAC) )的建议，离子选择性电极的建议，离子选择性电极一般采用如下分类：一般采用如下分类： 二、常用的离子选择电极二、常用的离子选择电极玻璃膜电极玻璃膜电极二、二

23、、 常用常用的离子选择性电极的离子选择性电极（2 2）玻璃电极及膜电位：）玻璃电极及膜电位： 玻璃电极是最早使用的离子选择性电极。玻璃电极是最早使用的离子选择性电极。 玻璃薄膜是决定电极性能的最重要组成部份。玻璃薄膜是决定电极性能的最重要组成部份。 内参比电极的电位是恒定的，与被测溶液的内参比电极的电位是恒定的，与被测溶液的PHPH无无关。关。 玻璃电极用作测玻璃电极用作测PHPH的指示电极，是因为跨越玻璃的指示电极，是因为跨越玻璃膜产生了膜电位。膜电位与待测溶液膜产生了膜电位。膜电位与待测溶液PHPH值有关。值有关。50（3 3）玻璃电极的优点）玻璃电极的优点 选择性高选择性高 ：膜电位的产

24、生不是电子的得失。其它：膜电位的产生不是电子的得失。其它离子不能进入敏感膜产生交换。当溶液中离子不能进入敏感膜产生交换。当溶液中Na+Na+浓度浓度比比H+H+浓度高浓度高10151015倍时，两者才产生相同的电位；倍时，两者才产生相同的电位； 不受溶液中氧化剂、还原剂、颜色、沉淀及胶体、不受溶液中氧化剂、还原剂、颜色、沉淀及胶体、杂质的影响杂质的影响，不易中毒；，不易中毒； 改变玻璃膜的组成改变玻璃膜的组成，可制成对其它阳离子响应的，可制成对其它阳离子响应的玻璃膜电极。玻璃膜电极。51气敏电极气敏电极如如，二氧化碳气敏电极：微孔气体渗透膜憎水但能透气，二氧化碳气敏电极：微孔气体渗透膜憎水但能

25、透气(由醋酸纤维、聚四由醋酸纤维、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。测定时，。测定时，CO2气体通过微孔渗透膜与中气体通过微孔渗透膜与中介溶液接触介溶液接触(中介液是中介液是0.001mol/L的的NaHCO3)；由于由于CO2与与H2O结合生成碳酸，结合生成碳酸，从而影响到碳酸氢钠的电离平衡。从而影响到碳酸氢钠的电离平衡。气敏电极气敏电极通过界面发生化学反通过界面发生化学反应进行工作的，离子电极用来应进行工作的，离子电极用来指示中介液中某一离子活度的指示中介液中某一离子活度的变化。溶解在水溶液中的气体，变化。溶解在水溶液中的气体，只要能生成可用离子选择性电只要能

26、生成可用离子选择性电极检出的离子，均可用气敏电极检出的离子，均可用气敏电极测定。极测定。用用pH玻璃电极间接测定玻璃电极间接测定CO2的的含量含量 气敏电极是一种气体传感器，测定溶液中的气体含量。气敏电极是一种气体传感器，测定溶液中的气体含量。原理：利用待测气体对某一化学平衡的影响，使平衡中某特定原理：利用待测气体对某一化学平衡的影响，使平衡中某特定离子的活度发生变化，来测定试液中被测气体的分压离子的活度发生变化，来测定试液中被测气体的分压(含量含量)。 在气敏电极的中介溶液中放入玻在气敏电极的中介溶液中放入玻璃电极。测量时，控制试液的酸璃电极。测量时，控制试液的酸碱度，使碱度，使CO2通过气

27、透膜扩散加通过气透膜扩散加入气敏电极；引起中介溶液入气敏电极；引起中介溶液pH的的改变。测定中介溶液的改变。测定中介溶液的pH值，即值，即可计算出试液中可计算出试液中CO2的浓度。的浓度。 CO2 + H2O = HCO3- + H+ NH3 + H2O = NH4+ + OH- SO2 + H2O = HSO3- + H+ 2NO2 + H2O = NO3- + NO2- + H+ H2S + H2O = HS- + H3O+ HCN + H2O = H3O+ + CN- HF + H2O = H3O+ + F- 凡是凡是溶于水释放溶于水释放H+的反应，都可以用的反应，都可以用pH玻璃电极检

28、出；玻璃电极检出；而后三种分别可以用而后三种分别可以用S2-、CN-、F-等离子选择性电极来检测。等离子选择性电极来检测。可用电极测定的气体可用电极测定的气体 酶的催化反应酶的催化反应专一强专一强；酶电极有极高的选择性。作为一种生物传感器，酶电极特别适用于；酶电极有极高的选择性。作为一种生物传感器，酶电极特别适用于生物医学、生物化学等领域。生物医学、生物化学等领域。酶电极酶电极 选择适合的选择适合的指示电极指示电极 制成具有催化活性的水不溶性制成具有催化活性的水不溶性酶膜酶膜 把酶膜固定在电极的表面把酶膜固定在电极的表面(酶的固定化酶的固定化) 酶电极的制作酶电极的制作过程过程将生物酶涂布在离

29、子选择性电极或其它传感器的敏感膜上，通过酶催化作将生物酶涂布在离子选择性电极或其它传感器的敏感膜上，通过酶催化作用，使待测物质产生能在该电极上响应的离子或化合物，间接测定该物质。用，使待测物质产生能在该电极上响应的离子或化合物，间接测定该物质。脲酶催化分解尿素产生脲酶催化分解尿素产生NH3、CO2，溶于水可得到不同产物溶于水可得到不同产物NH3、CO2、NH4+、HCO3-等，可用相应的离子选等，可用相应的离子选择性电极来检测它们，间接得到尿择性电极来检测它们，间接得到尿素的含量。素的含量。常用的固定化技术有：吸附、试剂交联、共价键合、 包埋法(酶与载体聚丙酰胺混合后直接包在电极敏感部分形成酶

30、凝胶层)。几种酶电极的品种与性能几种酶电极的品种与性能测定物质酶检测物测定范围(mol/L)葡萄糖葡萄糖氧化酶O210-42*10-2尿素(脲)脲酶NH310-510-2胆固醇胆固醇氧化酶H2O210-510-2L谷氨酸谷氨酸脱氢酶NH4+10-410-1L赖氨酸赖氨酸脱羧酶CO210-410-1 配制一系列已知活（浓）度的欲测离子的标配制一系列已知活（浓）度的欲测离子的标准溶液，逐一插入离子选择性电极和参比电极，准溶液，逐一插入离子选择性电极和参比电极，测出它们相应的测出它们相应的E E值，以值，以E E对对C C作图得标准曲线。在作图得标准曲线。在同样条件下测出未知溶液的同样条件下测出未知

31、溶液的E E值，即可从标准曲线值，即可从标准曲线上查出对应的欲测溶液的离子活（浓）度。上查出对应的欲测溶液的离子活（浓）度。 57三、离子选择电极的分析方法三、离子选择电极的分析方法（一）（一） 标准曲线法标准曲线法 当待测溶液的成份比较复杂，离子强度比较当待测溶液的成份比较复杂，离子强度比较大时，难以配制与待测溶液组成相近的标液，此大时，难以配制与待测溶液组成相近的标液，此时，采用标准加入法较适宜。时，采用标准加入法较适宜。 58（二）（二） 标准加入法标准加入法 （三）、仪器直读法（三）、仪器直读法 该法是能在离子计上直接读出被测离子的浓度，该法是能在离子计上直接读出被测离子的浓度，这种仪器称为专用离子计。例如：这种仪器称为专用离子计。例如：PHPH计、氟离子计等。计、氟离子计等。5960（一）（一） 单一型电解质分析仪单一型电解质分析仪 电解质分析法在临床检验中的应用电解质分析法在临床检验中的应用 61（二）（二） 组合型电解质分析仪组合型电解质分析仪 电解质分析法在临床检验中的应用电解质分析法在临床检验中的应用 电解质分析法在临床检验中的应用电解质分析法在临床检验中的应用 62（三）（三） 全自动生化分析仪全自动生化分析仪 第三节第三节 电泳分析技术电泳分析技术正极正