实验九 new 微丝的观察鬼笔环肽标记

1、实验九实验九 动物细胞内微丝结构的观察动物细胞内微丝结构的观察（鬼笔环肽标记法）（鬼笔环肽标记法）实验目的 1. 了解鬼笔环肽标记微丝结构的原理。 2 观察微丝束（应力纤维）在动物细胞内的分布。 3 学习细胞固定，穿透，染色等技术。 4 巩固荧光显微镜的使用技术。实验原理 actin-tracker green是一种actin绿色荧光探针，可以用于培养细胞或组织切片的actin特异性荧光染色。 actin-tracker green探针为荧光染料fitc标记的毒蕈肽(phalloidin)，即phalloidin-fitc，其分子量约为1251.4，最大激发波长为496nm，最大发射波长为51

2、6nm。可以用于细胞或组织内的微丝(microfilament)的荧光检测。 使用时的推荐稀释比例为1:200。如果每个片子需要使用200l染色工作液，每个包装的本产品足够用于200个片子 的染色。主要仪器与溶液 主要仪器 荧光显微镜、移液器（1000ul 和100ul) 材料：细胞爬片，两人一孔。 溶液 pbs配制的3.7%甲醛溶液。 0.1% triton x-100的pbs洗涤液 含有5%bsa和0.1% triton x-100的pbs按照1:200的比例稀释actin-tracker green实验步骤 a a 用用pbspbs洗涤细胞或组织切片洗涤细胞或组织切片2 2次。次。每次每

3、次0.4ml.0.4ml. b.b.弃去洗涤液，用弃去洗涤液，用pbspbs配制的配制的3.7%3.7%甲醛溶液室温固甲醛溶液室温固定细胞或组织切片约定细胞或组织切片约1010分钟。注意：分钟。注意：甲醇甲醇可以破可以破坏坏actinactin蛋白，因此不能使用含有甲醇的固定液。蛋白，因此不能使用含有甲醇的固定液。并且尽量使用不含甲醇的甲醛。并且尽量使用不含甲醇的甲醛。每孔每孔0.2 ml.0.2 ml. c.c.弃去固定液，用含弃去固定液，用含0.1% triton x-1000.1% triton x-100的的pbspbs洗洗涤涤2-42-4次，每次约次，每次约5 5分钟。分钟。每次每次

4、0.2 ml0.2 ml. . d d 弃去洗涤液，把弃去洗涤液，把actin-tracker greenactin-tracker green染色工染色工作液按照每个片子约作液按照每个片子约100l100l的比例滴加到片子上，的比例滴加到片子上，室温避光孵育室温避光孵育3030分钟。分钟。实验步骤 e. e. 用含用含0.1% triton x-1000.1% triton x-100的的pbspbs洗洗2-42-4次，每次次，每次约约5 5分钟。分钟。每次每次200ul200ul。 f. f. 在载玻片上加一滴在载玻片上加一滴pbs, pbs, 反扣盖玻片（生长有反扣盖玻片（生长有细胞的一面朝下），随后可以用荧光显微镜进行细胞的一面朝下），随后可以用荧光显微镜进行观察。观察。 为长期保存，可以在片子自然干燥后封片并于为长期保存，可以在片子自然干燥后封片并于44避光保存，保存时间可长达避光保存，保存时间可长达6 6个月左右。个月左右。实验结果荧光显微镜 激光共聚焦显微镜 显示的细胞中的微丝分布作业 1 为什么不能使用细胞松弛素b标记微丝结构？ 2 triton-x 100溶液处理细胞的作用是什么？ 3 本实验中能使用甲醇固定细胞吗？为什么？ 4 动物细