实验二血清γ球蛋白分离纯化与鉴定

1、实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 实验二实验二 血清血清球蛋白的分球蛋白的分 离纯化与鉴定离纯化与鉴定 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 层析技术 实验原理 实验思路 实验流程及操作注意事项 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 层层 析析 技技 术术 1 1层析法：又称色谱法，是一层析法：又称色谱法，是一 种广泛运用的物质分离纯化、分种广泛运用的物质分离纯化、分 析鉴定技术析鉴定技术. . 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 2. 2. 依据：混合物中各组分的理依据：混合物中各组分的理 化性质差异化性质差异吸附力、分子形吸附力、分子形 状、大小、酸碱性或分子极性状、大小、酸碱性或分子极性 、分子亲

2、和力以及分配系数。、分子亲和力以及分配系数。 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 固定相固定相固定不动固定不动 流动相流动相对固定相作单向相对运动，对固定相作单向相对运动， 推动样品中各组分通过固定相向前移推动样品中各组分通过固定相向前移 动。各组分理化性质不同，对流动相动。各组分理化性质不同，对流动相 和固定相具有不同的作用力，因此在和固定相具有不同的作用力，因此在 流动相推动样品通过固定相的过程中流动相推动样品通过固定相的过程中 ，通过不断地吸附、解吸、吸附、解，通过不断地吸附、解吸、吸附、解 吸作用，造成混合物中各组分在固定吸作用，造成混合物中各组分在固定 相中的迁移距离不等，达到分离。相

3、中的迁移距离不等，达到分离。 3 3基本原理：固定相和流动相基本原理：固定相和流动相 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 4 4分类：分类： 流动相的物理状态：气相和液相流动相的物理状态：气相和液相 气液气液/ /固，固，液固液固/ /液液 方式：纸、薄层、方式：纸、薄层、柱柱 原理：吸附、分配、原理：吸附、分配、凝胶凝胶、离子交、离子交 换、亲和、金属螯合、疏水、反相换、亲和、金属螯合、疏水、反相 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 5 5凝胶层析凝胶层析 ( (凝胶过滤、凝胶色谱、分凝胶过滤、凝胶色谱、分 子筛层析、分子排阻层析子筛层析、分子排阻层析) ) 定义：指混合物随流动相定义：指混合物

4、随流动相 流经固定相的层析柱时，混流经固定相的层析柱时，混 合物中各组分按其分子大小合物中各组分按其分子大小 不同而被分离的技术。不同而被分离的技术。 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 基本原理：基本原理： 固定相固定相：凝胶，惰性三维空间多孔：凝胶，惰性三维空间多孔 网状结构，故称分子筛，包括琼脂网状结构，故称分子筛，包括琼脂 糖、糖、交联葡聚糖交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼、聚丙烯酰胺、琼 脂糖脂糖- -葡聚糖复合凝胶。葡聚糖复合凝胶。 流动相流动相：洗脱液：洗脱液 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶 多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而

5、成，网状结构 珠状颗粒，商品名为珠状颗粒，商品名为Sephadex GSephadex G系列系列 G G交联度：交联度：G G后面的阿拉伯数字表示不同的后面的阿拉伯数字表示不同的 规格型号，有规格型号，有G-10G-10，G-15G-15，G-25G-25，G-50G-50，G-G- 7575，G-100G-100，G-150G-150，和，和G-200G-200八种，具体含义八种，具体含义 为凝胶得水值的为凝胶得水值的1010倍或吸水量（倍或吸水量（g g）/10g/10g干胶干胶 交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔 径越小，吸水性小；交联度越小，

6、孔径越大，径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大， 吸水性大。因此，吸水性大。因此，“G G”反映凝胶的交联程度反映凝胶的交联程度 ，膨胀程度及分部范围。，膨胀程度及分部范围。 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理 样品加于柱上，样品随洗脱液的流 动而向下移动，同时作垂直向下运 动和不定向扩散运动小分子可进 入凝胶空内部，流程长，速度慢， 后流出；大分子不能进入凝胶空内 部，颗粒间移动，流程短，先流出 大小分子彼此分开 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 l 分子

7、大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子 扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外 ；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出 层析柱，小分子尚在进行中 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 数学模型 Vo Vi Vt ViVi凝胶孔内水（内水）凝胶孔内水（内水） VoVo颗粒间水（外水）颗粒间水（外水） VgVg凝胶体积凝胶体积 总体积总体积VtVt= = Vi Vi + +VoVo+ +VgVg 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 KdKd分配系数：精确衡量混合物分配系数：精确衡量混合物 中某一待分离成分在凝胶柱内的洗中某一待分离成分在凝胶柱内的洗 脱行为，反映物质分子进入凝胶颗脱行为

8、，反映物质分子进入凝胶颗 粒的程度，是溶质分子大小的一个粒的程度，是溶质分子大小的一个 函数函数 VeVe洗脱体积：分离物被洗脱时洗脱体积：分离物被洗脱时 所用的洗脱液体积所用的洗脱液体积 VeVe= =VoVo+ +KdKdViVi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标 ，各物质浓度，各物质浓度/ /吸光度为纵坐标作吸光度为纵坐标作 图图 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 （1 1）完全被排阻的极端大分子，）完全被排阻的极端大分子，VeVe= =VoVo，KdKd=0=0 （2 2）中等分子，）中等分子，VeVe= =VoVo+ +KdKdViVi，00KdKd111 实

9、验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 影响因素影响因素 * *层析柱的选择及装填：层析柱的选择及装填： 柱大小柱大小分离样品量分离样品量 凝胶型号凝胶型号分辨率：各种分子筛的分辨率：各种分子筛的 孔隙大小分布有一定范围，有最大孔隙大小分布有一定范围，有最大 极限和最小极限。凝胶分离范围之极限和最小极限。凝胶分离范围之 外的分子，难以分离。如大小不同外的分子，难以分离。如大小不同 的两种全排阻分子的两种全排阻分子/ /完全渗透分子。完全渗透分子。 * *洗脱液：溶解待分离物质，不变性洗脱液：溶解待分离物质，不变性 * *加样量：加样量：1%1%5%5% * *凝胶的再

10、生凝胶的再生 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 凝胶型号凝胶型号颗粒大小（颗粒大小（m)m)溶胀体积溶胀体积(ml/g)(ml/g)分离范围（分离范围（MrMr） G-10G-1040401201202 23 37 710102 2 G-15G-1550501501502.52.53.5 3.5 1.51.510103 3 G-25G-2550501501504 46 61 110103 3 5 510103 3 G-50G-5040401201209 911111.51.510103 3 3 310104 4 G-75G-754040120120121215153 310103 3 8 81

11、0104 4 G-100G-1004040120120151520204 410103 3 1 110105 5 交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 实验原理实验原理 透析及超滤法 盐析、有机溶剂/免疫沉淀 电泳 凝胶层析 离子交换层析 超离心 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 共性共性： * *生命高分子：透析、超滤、超离心、生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶凝胶 层析层析 * *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化 膜和电荷膜和电荷盐析盐析/ /有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 * *两性

12、电解质和等电点：两性电解质和等电点：pH pIpH pI，蛋白质带，蛋白质带 负电；反之带正电负电；反之带正电电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析 * *有一定的功能：抗原性有一定的功能：抗原性 免疫沉淀免疫沉淀 个性个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度 、形状不同、形状不同 分离依据：蛋白质理化性质的和个性分离依据：蛋白质理化性质的和个性 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 清蛋白清蛋白 pI=4.9 57%pI=4.9 57%72%72% 1 2% 1 2%5%5% 2 pI6 4% 2 pI6 4%9%9% 6.5% 6.5%12%12% pI=7.3

13、2% pI=7.3 2%20%20% 球蛋白球蛋白 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 实验思路实验思路 分段盐析去除杂蛋白分段盐析去除杂蛋白 凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐 交联葡聚糖吸水浓缩交联葡聚糖吸水浓缩 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 上 午 完 成 下午 完成 先先 粗粗 后后 细细 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 分段盐析：分段盐析： 常用中性盐：常用中性盐：硫酸铵硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠 、磷酸钠等。、磷酸钠等。 硫酸铵硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分 段盐析效果好，不易引起变性。溶液段盐析效果

14、好，不易引起变性。溶液pHpH约约4.54.5 5.55.5，可用硫酸，可用硫酸/ /氨水按需要调节氨水按需要调节pHpH值。值。 分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、pIpI不同，不同， 所需的盐浓度、所需的盐浓度、pHpH也不一样。如清蛋白分子小，也不一样。如清蛋白分子小， 亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大， 亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓 度及度及pHpH可使各种蛋白质分段沉淀。可使各种蛋白质分段沉淀。 实验流程及操作注意事项实验流程及操作注意事项 实验

15、二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 影响因素：影响因素： 温度：温度与溶解度成正比。一般室温度：温度与溶解度成正比。一般室 温即可温即可, ,少数温度敏感型蛋白质需少数温度敏感型蛋白质需4 4度操度操 作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在 2525度比度比0 0度时溶解度低，更易盐析。度时溶解度低，更易盐析。 pHpH值：大多数蛋白质在值：大多数蛋白质在pIpI时溶解度最时溶解度最 低。低。pH=pIpH=pI效果更好。效果更好。 蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐 析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋 白

16、质含量在白质含量在2.5-3.0%2.5-3.0%。 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长 ，最好低温。也可用葡萄糖凝胶，最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-G- 25/5025/50过柱，用时较短。过柱，用时较短。 固定相：固定相：sephadex G-25sephadex G-25 流动相：流动相：pH7.4pH7.4的的0.01M0.01M磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（ 0.9%NaCl0.9%NaCl） 原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分 子。子。 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 浓缩：浓缩：se

17、phadex G-25sephadex G-25吸水，利吸水，利 用高分子性质。用高分子性质。 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 注意事项：注意事项： 1 1硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入 2 2流洗柱子：流洗柱子：3 34 4个柱长个柱长 3 3上样：转圈滴加，起跑线一致上样：转圈滴加，起跑线一致 4 4防止柱上液层干涸防止柱上液层干涸 5 5洗脱液收集无需分部，用载玻片检洗脱液收集无需分部，用载玻片检 测蛋白，无纳氏试剂测蛋白，无纳氏试剂 6 6G-25G-25干胶用纸条少量多次加入，液干胶用纸条少量多次加入，液 层高层高0.5mlPI PH=PI PHPI 电泳

18、用于分离物质的原理：电泳用于分离物质的原理： 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 蛋白质为两性电解质，有一定的等电 点，在大于其等电点的溶液中带负电 ，在电场中向阳极移动，由于各种蛋 白质的分子大小与结构不同，所带表 面电荷的多少不同，因而在电场中向 阳极移动的速度不同。经过一定的电 泳时间后可形成许多蛋白质区带，每 一个区带代表一组迁移率相近似的蛋 白质。 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的 羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸 酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具酯。溶于有机溶

19、剂后涂成薄膜，具 均一的泡沫状结构，有强渗透性。均一的泡沫状结构，有强渗透性。 电泳缓冲液：电泳缓冲液：pH8.6pH8.6的巴比妥缓冲的巴比妥缓冲 液液 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 清蛋白清蛋白 pI=4.9 57%pI=4.9 57%72%72% 1 2% 1 2%5%5% 2 pI6 4% 2 pI6 4%9%9% 6.5% 6.5%12%12% pI=7.3 2% pI=7.3 2%20%20% 球蛋白球蛋白 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 清蛋白清蛋白 1 1 2 2 清蛋白（清蛋白（albuminalbumin，A A）：）：383848g/L48g/L 球蛋白（球蛋白（globulinglobulin，G G）：）：151530g/L30g/L A/GA/G：正常值：正常值1.51.52.52.5 实验二血清球蛋白分离纯化与鉴 定 清蛋