常规病理学技术课件

1、常规病理学技术1 病理学技术概论 及常规病理技术 南方医科大学病理学系 申 洪 常规病理学技术2 课程简介课程简介 n内容：着重介绍重要的病理学技术及其应用 n目的：提供病理学研究所需的基本技术知识 体系和病理学研究的一些基本思路； 常规病理学技术3 课程结构： n常规病理学技术常规病理学技术 n细胞病理学技术及其在肿瘤病理学中的应用细胞病理学技术及其在肿瘤病理学中的应用 n电镜技术及其在病理学中的应用电镜技术及其在病理学中的应用 n定量病理学技术及其在病理学中的应用定量病理学技术及其在病理学中的应用 常规病理学技术4 基本要求基本要求 n基本概念基本概念 n基本原理基本原理 n基本方法和技术

2、关键基本方法和技术关键 n联系实际，思考应用联系实际，思考应用 常规病理学技术5 一、病理学技术概念范畴一、病理学技术概念范畴 n 1 1 病理学病理学 n 2 2 病理学技术病理学技术 n 广义概念广义概念 狭义概念：围绕病理形态学 常规病理学技术6 病理形态学技术类型病理形态学技术类型 尸体剖验技术尸体剖验技术 常规组织病理学技术常规组织病理学技术 常规细胞病理学技术常规细胞病理学技术 组织化学和细胞化学技术组织化学和细胞化学技术 免疫组织化学技术免疫组织化学技术 流式细胞技术流式细胞技术 超微结构技术超微结构技术 体视学技术：体视学技术： 定量病理学技术定量病理学技术 图像分析技术图像分

3、析技术 分子病理学技术分子病理学技术 激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 动物实验技术动物实验技术 三维重建技术三维重建技术 细胞培养技术细胞培养技术 常规病理学技术7 一、尸体剖验技术一、尸体剖验技术 目的意义：查出病因和病变，明确诊断及死因目的意义：查出病因和病变，明确诊断及死因 解释临床症状和体征等临床现象解释临床症状和体征等临床现象 及时发现和确诊新疾病，特别是传染病及时发现和确诊新疾病，特别是传染病 提供第一手科研材料提供第一手科研材料 法律手续：死者家属签字法律手续：死者家属签字 临床医生签字临床医生签字 单位签字单位签字 基本要求：研究生：参加病理解剖基本要求：研究生：参加病理解剖

4、 本科生：见习本科生：见习 常规病理学技术8 二 常规病理学技术 n 组织取材及固定技术 n 包埋 n 石蜡切片技术 n 冰冻切片技术 n HE染色 常规病理学技术9 标本的来源与收集标本的来源与收集 1 1、临床活检、临床活检 2 2、尸体解剖、尸体解剖 3 3、实验动物、实验动物 注意事项注意事项 1 1、检查申请单的姓名，标本的件数是否与、检查申请单的姓名，标本的件数是否与 之相符合。之相符合。 2 2、标本是否符合要求。、标本是否符合要求。 常规病理学技术10 （一）取材、固定（一）取材、固定 标本的来源与收集标本的来源与收集 1 1、临床活检、临床活检 2 2、尸体解剖、尸体解剖 3

5、 3、实验动物、实验动物 注意事项注意事项 1 1、检查申请单的姓名及标本件数是否相符。、检查申请单的姓名及标本件数是否相符。 2 2、标本是否符合要求。、标本是否符合要求。 常规病理学技术11 取材：取材： 切取病变组织或拟研究的组织切取病变组织或拟研究的组织 及时，尽可能新鲜及时，尽可能新鲜 迅速固定、冷藏迅速固定、冷藏 生理盐水、磷酸缓冲液等溶液生理盐水、磷酸缓冲液等溶液 刀要快，不要挤压组织刀要快，不要挤压组织 注意研究目的注意研究目的 培养培养 定量定量 对比观察对比观察 临床诊断临床诊断 常规病理学技术12 固固 定定 n（一）固定：用化学试剂保持尸体、器官、组（一）固定：用化学试

6、剂保持尸体、器官、组 n 织结构和细胞结构的固有形态结织结构和细胞结构的固有形态结 n 构的过程谓固定，所用的化学试构的过程谓固定，所用的化学试 n 剂谓固定剂或固定液。剂谓固定剂或固定液。 n 目的：防止自溶、腐败，保持良好结构目的：防止自溶、腐败，保持良好结构 n 原理：组织及细胞内蛋白凝固，或使有原理：组织及细胞内蛋白凝固，或使有 n 关成分沉淀、变性，成为不溶性关成分沉淀、变性，成为不溶性 n 物质。物质。 n 方法：浸泡方法：浸泡 n 灌注：局部灌注、全身灌注灌注：局部灌注、全身灌注 n 蒸汽熏蒸蒸汽熏蒸 常规病理学技术13 固定时间 固定时间: n 常规组织病理学常规组织病理学:

7、可长时间固定可长时间固定 n 细胞病理学：可长时间固定细胞病理学：可长时间固定 n 细胞化学：不宜过长，约细胞化学：不宜过长，约1小时为宜小时为宜 固定后处理固定后处理： n 充分洗涤充分洗涤 固定时间越长，洗涤时间也应相应增加固定时间越长，洗涤时间也应相应增加 常规病理学技术14 固定注意事项固定注意事项 n1. 固定液有毒性，注意自身防护固定液有毒性，注意自身防护 n2. 及时，尽可能新鲜及时，尽可能新鲜 n3. 超微结构观察：低温固定超微结构观察：低温固定 n4. 注意不同研究目的对固定液的特殊需要注意不同研究目的对固定液的特殊需要 n 细胞化学细胞化学 n 超微结构超微结构 n 细胞涂

8、片巴氏染色细胞涂片巴氏染色 n 5. 固定液用量：足，必要时及时更换。固定液用量：足，必要时及时更换。 n 6. 固定时间固定时间 n 7. 固定后洗涤固定后洗涤 常规病理学技术15 常用固定液常用固定液 甲醛溶液：甲醛溶液：4甲醛，或甲醛，或 10福尔马林福尔马林 40甲醛（福尔马林，甲醛（福尔马林，Formeldehyde） 用于无特要求的组织常规固定用于无特要求的组织常规固定 乙醇（乙醇（Ethyl Alcohol）: 95% 用于细胞病理学涂片常规固定，糖原固定用于细胞病理学涂片常规固定，糖原固定 乙醇乙醚混合固定液乙醇乙醚混合固定液: 95% ： 95%乙醇乙醇+ 95%乙醚（乙醚（

9、1:1） 用于细胞涂片巴氏染色用于细胞涂片巴氏染色 常规病理学技术16 （二）石蜡包埋制样（二）石蜡包埋制样 组织块脱水：组织块脱水： 逐级乙醇脱水逐级乙醇脱水 透明：二甲苯透明：二甲苯 浸蜡：浸蜡：65C 包埋：溶解蜡包埋：溶解蜡 常规病理学技术17 人工脱水程序人工脱水程序 ( (适应于适应于3 3mmmm厚的组织块厚的组织块) ) 1 1、30%30%酒精酒精 24 24h h 2 2、50%50%酒精酒精 24 24h h 3 3、70%70%酒精酒精 24 24h h 4 4、80%80%酒精酒精 24 24h h 5 5、90%90%酒精酒精 12 12h h 6 6、95%95%

10、酒精酒精 4 4h h 7 7、95%95%酒精酒精 4 4h h 8 8、100%100%酒精酒精 2 2h h 9 9、100%100%酒精酒精 2 2h h 10 10 二甲苯二甲苯 40 40minmin 11 11 二甲苯二甲苯 40 40minmin 12 12 石蜡（软）石蜡（软） 1 1h h 13 13 石蜡石蜡 1 1h h 14 14 石蜡石蜡 1 1h h 常规病理学技术18 （三）石蜡切片（三）石蜡切片 常规病理学技术19 (四四) HE染色：苏木素伊红染色染色：苏木素伊红染色 1 脱蜡脱蜡 （二甲苯）（二甲苯） 2 水化水化 （逐级乙醇水化：（逐级乙醇水化：1003

11、0） 3 染苏木素染苏木素 4 1盐酸酒精分化盐酸酒精分化 n返兰返兰 n逐级乙醇脱水逐级乙醇脱水 30 (或或50) 95 伊红染色伊红染色 逐级乙醇脱水逐级乙醇脱水 （95100） 二甲苯透明二甲苯透明 封片：中性树胶盖玻片封片：中性树胶盖玻片 常规病理学技术20 HEHE染色法程序染色法程序 常规病理学技术21 三、常规细胞病理学技术三、常规细胞病理学技术 细胞病理学（细胞病理学（cytopathology） n 诊断细胞学（诊断细胞学（diagnostic cytology） n 临床细胞学（临床细胞学（clinical cytology）。）。 n 该学科是利用身体器官组织正常或病变

12、的该学科是利用身体器官组织正常或病变的 离体细胞进行涂片，经显微镜观察，做出疾病诊离体细胞进行涂片，经显微镜观察，做出疾病诊 断，特别是肿瘤良恶性诊断断，特别是肿瘤良恶性诊断. n 细胞病理学方法简便易行、诊断准确、可细胞病理学方法简便易行、诊断准确、可 靠，已成为癌症早期诊断的重要手段之一，可广靠，已成为癌症早期诊断的重要手段之一，可广 泛应用于临床和大量人群防癌普查。泛应用于临床和大量人群防癌普查。 常规病理学技术22 三、常规细胞病理学技术三、常规细胞病理学技术 一、取材、涂片制备一、取材、涂片制备 痰涂片、胸水、腹水及尿液制片痰涂片、胸水、腹水及尿液制片 二、固定二、固定 三、染色三、

13、染色 (巴氏染色巴氏染色) 常规病理学技术23 常用固定液常用固定液 （1）等量）等量95%乙醇和乙醚混合液乙醇和乙醚混合液 （2）氯仿酒精固定液）氯仿酒精固定液 （3）95%酒精固定液酒精固定液 （4）福尔马林固定液）福尔马林固定液 细胞学研究，固定液选择要根据实验要细胞学研究，固定液选择要根据实验要 求条件而定，如用细胞涂片作原位求条件而定，如用细胞涂片作原位PCR， 固定液要选用多聚甲醛。固定液要选用多聚甲醛。 常规病理学技术24 巴氏染色步骤巴氏染色步骤 1 1标本标本9595酒精固定酒精固定3-53-5分钟分钟 2 2HarrisHarris苏木素液苏木素液5-105-10分钟分钟

14、3 3水（蒸馏水或自来水）漂洗水（蒸馏水或自来水）漂洗2-32-3次次 4 41 1盐酸水溶液（或盐酸水溶液（或1 1盐酸酒精液）盐酸酒精液） 浸浸1-31-3次次 5 5自来水浸洗自来水浸洗1-21-2次次 6 6自来水或稀碳酸锂（自来水或稀碳酸锂（100100mlml蒸馏水中加碳酸锂饱蒸馏水中加碳酸锂饱 和液和液1 1滴），涂片返蓝为止滴），涂片返蓝为止 常规病理学技术25 7 7依次置入依次置入707080809595酒精，酒精， 各各2 2分钟分钟 8 8桔黄桔黄G6G6液，液，1 1分钟分钟 9 99595酒精酒精、缸，各缸，各1 1分钟分钟 1010EA36EA36液，液，5 5分

15、钟分钟 11119595酒精酒精、，各，各1 1分钟分钟 1212无水酒精无水酒精、，各，各1 1分钟分钟 1313二甲苯二甲苯、，各，各2 2分钟分钟 1414中性树胶盖片封固中性树胶盖片封固 常规病理学技术26 四、组织化学和细胞化学技术四、组织化学和细胞化学技术 用化学反应原理，在切片上滴加某用化学反应原理，在切片上滴加某 种化学试剂，使之与组织或细胞中的生种化学试剂，使之与组织或细胞中的生 物化学物质结合，再用显色剂使之显色，物化学物质结合，再用显色剂使之显色， 达到定位、定性地显示组织或细胞中的达到定位、定性地显示组织或细胞中的 某种物质成分，这种技术称为组织化学某种物质成分，这种技

16、术称为组织化学 和细胞化学技术。其结果可用显微镜和和细胞化学技术。其结果可用显微镜和 电镜观察。结合定量病理学技术，还可电镜观察。结合定量病理学技术，还可 对有关成分定量。对有关成分定量。 常规病理学技术27 应应 用用 糖类糖类 脂类脂类 核酸核酸 酶类酶类 胶原纤维胶原纤维 弹力纤维弹力纤维 神经纤维神经纤维 细胞膜、核膜结构细胞膜、核膜结构 常规病理学技术28 五、免疫组织化学技术五、免疫组织化学技术 概念：免疫组织化学技术是指利用已知的抗概念：免疫组织化学技术是指利用已知的抗 体与组织中相应的抗原结合，并利用体与组织中相应的抗原结合，并利用 显色剂在原位将抗原物质显示出来显色剂在原位将

17、抗原物质显示出来 原理：抗原抗体显色剂原理：抗原抗体显色剂 特点：在组织中原位显示某种特异性抗原特点：在组织中原位显示某种特异性抗原 常用显色剂种类：酶、金属粒子、同位素常用显色剂种类：酶、金属粒子、同位素 生物素、化学显色剂（生物素、化学显色剂（DAB） 结果观察：显微镜、透射电镜结果观察：显微镜、透射电镜 常规病理学技术29 六、超微结构的基本技术六、超微结构的基本技术 超微结构是在高分辨条件下观察到的超微结构是在高分辨条件下观察到的 细胞膜、细胞核、核仁、核膜、各种细胞细胞膜、细胞核、核仁、核膜、各种细胞 器、微绒毛、纤毛、细胞连接结构及胶原器、微绒毛、纤毛、细胞连接结构及胶原 纤维、弹

18、力纤维等光镜水平观察不到的细纤维、弹力纤维等光镜水平观察不到的细 微结构。微结构。 常规病理学技术30 （一）透射电镜技术（一）透射电镜技术 1. 取材：取材：11mm3 2. 固定固定: 2%戊二醛戊二醛 2h 1%锇酸锇酸 12h 3. 脱水：逐级丙酮，环氧丙烷脱水：逐级丙酮，环氧丙烷 4. 包埋及聚合：浸透、包埋（包埋及聚合：浸透、包埋（Epon812） 聚合（硬化）、时间聚合（硬化）、时间 5. 超薄切片：超薄切片机超薄切片：超薄切片机 6. 染色：饱和醋酸铀、染色：饱和醋酸铀、1柠檬酸铅柠檬酸铅 7. 透射电镜观察透射电镜观察 常规病理学技术31 （二）扫描电镜技术（二）扫描电镜技术

19、 1. 取材：取材：11mm3 2. 固定固定: 2%戊二醛戊二醛 2h 1%锇酸锇酸 12h 3. 脱水：逐级丙酮，环氧丙烷脱水：逐级丙酮，环氧丙烷 4. 干燥：临界点干燥，醋酸异戊酯干燥：临界点干燥，醋酸异戊酯 5. 喷金：喷金： 6. 扫描电镜观察扫描电镜观察 常规病理学技术32 七、定量病理学技术七、定量病理学技术 体视学体视学 (Stereology)： 二维结构信息定量推论三维结构信息二维结构信息定量推论三维结构信息 研究内容研究内容： 二维定量推论三维的原理、方法及应用，二维定量推论三维的原理、方法及应用， 图像分析原理和方法图像分析原理和方法 生物体视学生物体视学 (Biolo

20、gical Stereology) 用体视学原理和方法研究生物组织的三维用体视学原理和方法研究生物组织的三维 结构，并据生物组织的结构特点研究相应的体结构，并据生物组织的结构特点研究相应的体 视学测试方法称为生物体视学视学测试方法称为生物体视学 常规病理学技术33 n形态测量学（形态测量学（Morphometry） n平面测量学（平面测量学（Planimetry） n体视学体视学( (Stereology)Stereology) n 形态结构要素计数，如核分裂计数形态结构要素计数，如核分裂计数 n 显微分光光度术显微分光光度术 n 流式细胞术流式细胞术 n 激光共聚焦显微图像分析激光共聚焦显微

21、图像分析 n 图像分析图像分析 常规病理学技术34 特特 点点 n给出量化结果给出量化结果 n提高结果表达的客观性和准确性提高结果表达的客观性和准确性 常规病理学技术35 应应 用用 诊断诊断 预后分析预后分析 基础数据基础数据 三维结构定量分析三维结构定量分析 形态与机能有机结合形态与机能有机结合 常规病理学技术36 八、分子病理学技术八、分子病理学技术 广义概念：广义概念： 狭义概念：将分子生物学方法与病理形狭义概念：将分子生物学方法与病理形 态学技术相结合，从分子生物学水平原位态学技术相结合，从分子生物学水平原位 阐明病变的特点和规律谓分子病理学技术。阐明病变的特点和规律谓分子病理学技术

22、。 原位原位PCR技术技术 原位杂交技术原位杂交技术 显微切割技术显微切割技术 常规病理学技术37 九、其他病理学技术 细胞及组织培养技术细胞及组织培养技术 细胞及细胞器分离技术细胞及细胞器分离技术 显微切割技术显微切割技术 显微摄影技术显微摄影技术 核仁组成区技术核仁组成区技术 荧光染色技术荧光染色技术 核移植技术核移植技术 酶组织化学技术酶组织化学技术 放射自显影技术放射自显影技术 流式细胞技术流式细胞技术 激光共聚焦扫描显微镜技术激光共聚焦扫描显微镜技术 常规病理学技术38 附: 常规病理学技术详解 n 常规病理学技术39 一、标本的来源与收集一、标本的来源与收集 ( (一一) ) 1

23、1、临床活检、临床活检 2 2、尸体解剖、尸体解剖 3 3、实验动物、实验动物 （二）（二） 1 1、检查申请单的姓名，标本的件数是否与之相、检查申请单的姓名，标本的件数是否与之相 符合。符合。 2 2、标本是否符合要求。、标本是否符合要求。 常规病理学技术40 二、标本的处理标本的处理 1、对送检物进行编号登记，以免混乱。、对送检物进行编号登记，以免混乱。 2、小组织全部包埋。、小组织全部包埋。 3、大块组织切取其中部分组织，如肿瘤和肿瘤、大块组织切取其中部分组织，如肿瘤和肿瘤 边缘组织，剩余组织在病理报告发出后约一边缘组织，剩余组织在病理报告发出后约一 个星期后处理。个星期后处理。 常规病

24、理学技术41 三、组织的固定三、组织的固定 将取好的组织放入固定液进行固定，活检组将取好的组织放入固定液进行固定，活检组 织的固定，由于受到时间的限制，不能过多的占织的固定，由于受到时间的限制，不能过多的占 用时间，最多只能占用时间，最多只能占2 2小时，其它的组织可固定小时，其它的组织可固定 10-2010-20小时，但最好不要超过小时，但最好不要超过2424小时，因这个时小时，因这个时 间对以后的免疫组化的显示都有影响。间对以后的免疫组化的显示都有影响。 常规病理学技术42 四、固定的作用四、固定的作用 固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固， 终止或减少外

25、源性酶和内源性酶的反应，防止细终止或减少外源性酶和内源性酶的反应，防止细 胞自溶，以保持组织的固有形态和结构，更重要胞自溶，以保持组织的固有形态和结构，更重要 的是保存组织或细胞的抗原性，不但使抗原不致的是保存组织或细胞的抗原性，不但使抗原不致 失活，还要使抗原不发生弥散，以免在免疫组化失活，还要使抗原不发生弥散，以免在免疫组化 染色时产生过深的背景。染色时产生过深的背景。 常规病理学技术43 五、固定的目的五、固定的目的 1 1、能防止细菌的腐蚀和抑制组织的自溶、能防止细菌的腐蚀和抑制组织的自溶 2 2、能凝固或沉淀细胞内或组织液的蛋白等、能凝固或沉淀细胞内或组织液的蛋白等 3 3、使组织硬

26、化，便于切块、使组织硬化，便于切块 4 4、对某些具有传染性的标本，能防止其扩散、对某些具有传染性的标本，能防止其扩散 5 5、保存组织细胞中固有的物质、保存组织细胞中固有的物质 6 6、保存好大体标本、保存好大体标本 7 7、可增强染色、可增强染色 常规病理学技术44 六、固定时的注意事项六、固定时的注意事项 1 1、组织块越新鲜越好、组织块越新鲜越好 2 2、组织块不宜过厚过大、组织块不宜过厚过大 3 3、根据需要选择适当的固定液、根据需要选择适当的固定液 4 4、组织固定时间不宜过长，也不能太短、组织固定时间不宜过长，也不能太短 5 5、固定液的量要充分，、固定液的量要充分，1 1：5

27、5 6 6、不应强行将组织装入较小的容器内、不应强行将组织装入较小的容器内 7 7、特殊方法需要特殊的固定液、特殊方法需要特殊的固定液 常规病理学技术45 七、固定液的选择七、固定液的选择 1 1、尽量选择对组织收缩少，渗透快的固定液、尽量选择对组织收缩少，渗透快的固定液 2 2、选择较通用的固定液，既能做好、选择较通用的固定液，既能做好HEHE的染色，又能的染色，又能 做免疫组化标记做免疫组化标记 3 3、特殊的病例选择特殊的固定液、特殊的病例选择特殊的固定液 如：如： 狂犬病狂犬病丙酮丙酮 磷酸酶磷酸酶丙酮丙酮 糖原糖原无水酒精无水酒精 常规病理学技术46 八、固定液的分类八、固定液的分类

28、 .醛类：甲醛、戊二醛、多聚乙醛、丙稀醛等醛类：甲醛、戊二醛、多聚乙醛、丙稀醛等 .氧化剂类：四氧化饿（奥酸）、高锰酸钾、氧化剂类：四氧化饿（奥酸）、高锰酸钾、 重重鉻鉻酸钾等酸钾等 .蛋白变性类：醋酸、甲醇、乙醇等蛋白变性类：醋酸、甲醇、乙醇等 .其它：氯化汞，苦味酸等。其它：氯化汞，苦味酸等。 常规病理学技术47 九、固定液的使用九、固定液的使用 （一）甲醛（一）甲醛（formaldehydeformaldehyde） 一般市售的含一般市售的含37-40%37-40%，平时使用都把它看为，平时使用都把它看为100%100%。 它由甲醛气体饱和于水而成。比重为它由甲醛气体饱和于水而成。比重为

29、1.121.12，有一股刺，有一股刺 鼻的气味。甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂鼻的气味。甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂 的，因为它能和多种不同的功能基团结合。如近来的的，因为它能和多种不同的功能基团结合。如近来的 抗原修复就是认为组织中的蛋白与醛产生交联蛋白后，抗原修复就是认为组织中的蛋白与醛产生交联蛋白后， 要将它们显示出来，就必须应用温度高达要将它们显示出来，就必须应用温度高达9292以上的以上的 抗原修复液，才能将其交联的醛键打开，与后来的抗抗原修复液，才能将其交联的醛键打开，与后来的抗 体结合，将其表达出来。体结合，将其表达出来。 常规病理学技术48 甲醛的优点：甲醛的优点

30、： 1、收缩较小、收缩较小 2、固定较为均匀，穿透力强、固定较为均匀，穿透力强 3、能使组织硬化并富有弹性、能使组织硬化并富有弹性 4、能保存脂肪及脂类物质、能保存脂肪及脂类物质 5、成本较低、成本较低 常规病理学技术49 甲醛的缺点：甲醛的缺点： 1、成分不纯，含少量的甲醇，影响酶反应、成分不纯，含少量的甲醇，影响酶反应 2、含少量的甲酸，易产生色素、含少量的甲酸，易产生色素 3、不能固定尿酸和糖类物质、不能固定尿酸和糖类物质 4、易挥发、污染环境、易挥发、污染环境 5、易产生醛基、封闭抗原、易产生醛基、封闭抗原 常规病理学技术50 应用甲醛配成的固定液有：应用甲醛配成的固定液有： 1 1、

31、缓冲福尔马林固定液（、缓冲福尔马林固定液（neutral buffered neutral buffered formaaldehydeformaaldehyde） NaH NaH2 2POPO4 4HH2 2O O 4g 4g Na Na2 2HPOHPO4 4（无水）无水）6565g g 蒸馏水蒸馏水 900 900mlml 甲醛甲醛 100 100mlml 常规病理学技术51 2 2、10%10%福尔马林固定液福尔马林固定液 甲醛甲醛 10 10mlml 自来水自来水 90 90mlml 3 3、10%10%福尔马林盐固定液福尔马林盐固定液 甲醛甲醛 10 10mlml 自来水自来水 9

32、0 90mlml NaCl NaCl0.9g0.9g 常规病理学技术52 4 4、BouinBouin氏固定液氏固定液 苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液 75 75mlml 甲醛甲醛 25 25mlml 冰醋酸冰醋酸 5 5mlml 常规病理学技术53 5 5、ZonkerZonker氏液氏液 氯化汞氯化汞 5 5g g 重铬酸钾重铬酸钾 2.5 2.5g g 硫酸钠硫酸钠 1 1g g 水水 100 100mlml 注：该固定液固定时间为注：该固定液固定时间为16-2416-24h h，染色前应用碘染色前应用碘 酒除去汞盐的沉淀，否则会影响染色后切酒除去汞盐的沉淀，否则会影响染色后切 片的观

33、察。片的观察。 常规病理学技术54 （二）酒精（二）酒精（alcoholalcohol） 有无水酒精（有无水酒精（99.8%99.8%）和工业酒精（）和工业酒精（95%95%）在）在 病理技术方面，酒精是一种重要的试剂，它可配病理技术方面，酒精是一种重要的试剂，它可配 成不同的浓度来进行脱水，如：成不同的浓度来进行脱水，如：60%60%、70%70%、80%80%、 90%90%、95%95%等，在切片染色前，用酒精来除去二甲等，在切片染色前，用酒精来除去二甲 苯，在染完色后则用其来脱水。苯，在染完色后则用其来脱水。 常规病理学技术55 应当注意的是，组织脱水时应根据组织的应当注意的是，组织脱

34、水时应根据组织的 大小、器官或部位、取材的大小来确定脱水时间，大小、器官或部位、取材的大小来确定脱水时间， 一般认为浓度越低，脱水时间可以相对延长，如一般认为浓度越低，脱水时间可以相对延长，如 70%70%可用来长期保存标本，但如果在可用来长期保存标本，但如果在100%100%的酒精的酒精 里时间就不能太长，否则组织易脆不利于切片。里时间就不能太长，否则组织易脆不利于切片。 酒精可以与其它试剂混合，配成混合固定液，如酒精可以与其它试剂混合，配成混合固定液，如 AAFAAF固定液。固定液。 常规病理学技术56 酒精的优点：酒精的优点： 1、可以保存糖原和尿酸结晶。、可以保存糖原和尿酸结晶。 2、

35、能在任何比例的情况下与水混合。、能在任何比例的情况下与水混合。 3、能溶解苯类物质，为染色法中的桥梁试剂。、能溶解苯类物质，为染色法中的桥梁试剂。 4、能脱去切片上的水份。、能脱去切片上的水份。 5、可配成混合固定液。、可配成混合固定液。 6 、可作为保存标本的固定液。、可作为保存标本的固定液。 7 、可用来消毒。、可用来消毒。 常规病理学技术57 洒精的缺点：洒精的缺点： 1、可溶解脂类及脂肪物质。、可溶解脂类及脂肪物质。 2、可沉淀白蛋白，球和核蛋白。、可沉淀白蛋白，球和核蛋白。 3、渗透力不强。、渗透力不强。 4、可脱去某些已着染切片的颜色。、可脱去某些已着染切片的颜色。 5、不作为单独

36、的固定液。、不作为单独的固定液。 6、价格昂贵。、价格昂贵。 常规病理学技术58 病理组织切片的制作病理组织切片的制作 常规病理学技术59 一、石蜡切片一、石蜡切片 （一）组织脱水（一）组织脱水 人体或各种动物的各种组织，都含有人体或各种动物的各种组织，都含有 大量的水分。在石蜡切片中，水与蜡不能大量的水分。在石蜡切片中，水与蜡不能 相混合，必须想办法将含于组织中的水分相混合，必须想办法将含于组织中的水分 脱去，才能完成一系列的操作过程，制作脱去，才能完成一系列的操作过程，制作 好的切片。好的切片。 常规病理学技术60 1 1、人工脱水法优点：、人工脱水法优点： （1 1）可根椐不同的组织选择

37、最佳时间。）可根椐不同的组织选择最佳时间。 （2 2）可避免细小的组织经受不必要的脱水）可避免细小的组织经受不必要的脱水 时间时间, ,防止组织的硬脆防止组织的硬脆 （）可灵活掌握，随时进行观察和调（）可灵活掌握，随时进行观察和调 整整 常规病理学技术61 2 2、人工脱水法的不是之处：、人工脱水法的不是之处： （1 1）需耗人力；）需耗人力； （2 2）必须在白天完成，晚上无法进行换液；）必须在白天完成，晚上无法进行换液； （3 3）如机器发生故障，组织块被搁置在外）如机器发生故障，组织块被搁置在外 边，致使组织干涸，影响了制片的质边，致使组织干涸，影响了制片的质 量。量。 常规病理学技术6

38、2 人工脱水程序人工脱水程序 ( (适应于适应于3 3mmmm厚的组织块厚的组织块) ) 1 1、80%80%酒精酒精 24 24h h 2 2、90%90%酒精酒精 12 12h h 3 3、95%95%酒精酒精 4 4h h 4 4、95%95%酒精酒精 4 4h h 5 5、100%100%酒精酒精 2 2h h 6 6、100%100%酒精酒精 2 2h h 7 7、二甲苯二甲苯 40 40minmin 8 8、二甲苯二甲苯 40 40minmin 9 9、石蜡（软）石蜡（软） 1 1h h 1010、石蜡石蜡 1 1h h 1111、石蜡、石蜡 1 1h h 常规病理学技术63 细小

39、组织脱水程序细小组织脱水程序 （适合于胃、肠镜活检，肝、肺、肾穿刺活检的（适合于胃、肠镜活检，肝、肺、肾穿刺活检的 组织）组织） 1 1、80%80%酒精酒精10-1510-15minmin 2 2、90%90%酒精酒精10-1510-15minmin 3 3、95%95%酒精酒精10-1510-15minmin 4 4、100%100%酒精酒精10-1510-15minmin 5 5、二甲苯二甲苯5-105-10minmin 6 6、石蜡、石蜡15-2015-20minmin 常规病理学技术64 ShandanShandan全封闭电脑控制全自动组织脱水机全封闭电脑控制全自动组织脱水机 该机由

40、电脑、反应缸和试剂储存缸三该机由电脑、反应缸和试剂储存缸三 部分构成。部分构成。 电脑屏幕可显示时间、温度、所需时电脑屏幕可显示时间、温度、所需时 间、是否用真空负压等，可根据不同的时间、是否用真空负压等，可根据不同的时 间要求，编制间要求，编制9 9套不同的组织脱水程序。套不同的组织脱水程序。 常规病理学技术65 1 1、正常室温脱水程序、正常室温脱水程序 A A、10%10%福尔马林福尔马林 2 2h h B B、90%90%酒精酒精 1.5 1.5h h C C、95%95%酒精酒精 1.5 1.5h h D D、95%95%酒精酒精 1 1h h E E、95%95%酒精酒精 1 1h

41、 h F F、100%100%酒精酒精 1 1h h G G、100%100%酒精酒精1 1h h H H、100%100%酒精酒精1 1h h I I、二甲苯二甲苯4040minmin J J、二甲苯二甲苯4040minmin K K、石蜡石蜡6565真空负压真空负压1 1h h L L、石蜡石蜡6565真空负压真空负压1 1h h 常规病理学技术66 2 2、加温脱水程序、加温脱水程序 应用正常室温的脱水时间，再编入加应用正常室温的脱水时间，再编入加 温程序，加温的温度一般在温程序，加温的温度一般在37-4037-40 3 3、真空负压脱水程序、真空负压脱水程序 应用正常室温的脱水时间，再

42、编入真应用正常室温的脱水时间，再编入真 空负压脱水程序空负压脱水程序 常规病理学技术67 4 4、周末程序、周末程序 A A、10%10%福尔马林福尔马林1010h h B B、90%90%酒精酒精1010h h C C、95%95%酒精酒精1010h h D D、95%95%酒精酒精1010h h E E、95%95%酒精酒精1010h h F F、100%100%酒精酒精2 2h h G G、100%100%酒精酒精2 2h h H H、100%100%酒精酒精2 2h h I I、二甲苯二甲苯1 1h h J J、二甲苯二甲苯1 1h h K K、石蜡石蜡6565真空负压真空负压1 1h

43、 h L L、石蜡石蜡6565真空负压真空负压1 1h h 常规病理学技术68 该机的特点：该机的特点： 1 1、容量大，一次可处理、容量大，一次可处理250-300250-300个包埋盒。个包埋盒。 2 2、全部密闭，试剂不易挥发，保护了环境。、全部密闭，试剂不易挥发，保护了环境。 3 3、带有定期的搅动装置，使组织固定均匀，、带有定期的搅动装置，使组织固定均匀， 脱水彻底，浸蜡充分。脱水彻底，浸蜡充分。 4 4、脱水过程可使用真空负压和加热。、脱水过程可使用真空负压和加热。 5 5、该机占地量小。、该机占地量小。 常规病理学技术69 组织透明组织透明 应用于透明组织的试剂有很多种，有：应用

44、于透明组织的试剂有很多种，有： 二甲苯，三氯甲烷（氯仿），香柏油，苯二甲苯，三氯甲烷（氯仿），香柏油，苯 酚，松节油等。酚，松节油等。 常规病理学技术70 二甲苯的主要性能和使用二甲苯的主要性能和使用 它是一种透明无色的液体，挥发性强，它是一种透明无色的液体，挥发性强， 打开后即可闻到它的味道。它可溶于洒精，打开后即可闻到它的味道。它可溶于洒精， 丙酮等含醇类的物质，也可溶解石蜡，但丙酮等含醇类的物质，也可溶解石蜡，但 不溶于水。当脱完水的组织放入二甲苯后，不溶于水。当脱完水的组织放入二甲苯后， 经过一定的时间组织即可透明，如果组织经过一定的时间组织即可透明，如果组织 四周透明，中间留有白点，

45、则说明中间部四周透明，中间留有白点，则说明中间部 分没有彻底脱水，此时应将组织重新放回分没有彻底脱水，此时应将组织重新放回 洒精脱水。但经这样处理后的组织切片效洒精脱水。但经这样处理后的组织切片效 果较差。果较差。 常规病理学技术71 （二（二）组织浸蜡组织浸蜡 将透明的组织移放入将透明的组织移放入6565左右的电热左右的电热 恒温箱或脱水机上的特设蜡缸中，浸渍一恒温箱或脱水机上的特设蜡缸中，浸渍一 定的时间，这个过程称为浸蜡。定的时间，这个过程称为浸蜡。 常规病理学技术72 1 1、可起到填充、支撑的作用。、可起到填充、支撑的作用。 组织经酒精、二甲苯的作用后，其中组织经酒精、二甲苯的作用后

46、，其中 有许多物质被溶解去，如脂肪及脂类物质、有许多物质被溶解去，如脂肪及脂类物质、 糖原等。因而遗留下许多腔隙，妨碍了切糖原等。因而遗留下许多腔隙，妨碍了切 片。在切片时由于诱导剂的作用下石蜡可片。在切片时由于诱导剂的作用下石蜡可 以浸入到物质的各个角落，当石蜡冷却时，以浸入到物质的各个角落，当石蜡冷却时， 浸入到各处的石蜡就填充在各处的空隙，浸入到各处的石蜡就填充在各处的空隙， 包括血管和器官等。使组织保持原有的形包括血管和器官等。使组织保持原有的形 状，也使包埋后蜡块保持平整，便于切片。状，也使包埋后蜡块保持平整，便于切片。 常规病理学技术73 2 2、使切片能完整的切除并保持切片的美观

47、、使切片能完整的切除并保持切片的美观 3 3、石蜡的使用、石蜡的使用 （1 1）石蜡的性质）石蜡的性质 它是一种碳氢化合物，熔点它是一种碳氢化合物，熔点45-7045-70以上。以上。 常规病理学技术74 （2 2）石蜡熔点的种类）石蜡熔点的种类 45 45 52-54 52-54 54-56 54-56 56-58 56-58 58-60 58-60 60-62 60-62 常规病理学技术75 （3 3）石蜡性质的改善）石蜡性质的改善 增加石蜡的硬度，如加入脂蜡酸、柏油、增加石蜡的硬度，如加入脂蜡酸、柏油、 杨梅蜡等。杨梅蜡等。 增加石蜡的粘度，如加入蜂蜡、硬脂肪增加石蜡的粘度，如加入蜂蜡、

48、硬脂肪 等。等。 加热促进石蜡性质的改善加热促进石蜡性质的改善 熔化熔化冷却冷却熔化熔化 常规病理学技术76 4、浸蜡的方法、浸蜡的方法 传统浸蜡法传统浸蜡法 将透明好的组织放入熔化的石蜡中浸将透明好的组织放入熔化的石蜡中浸 渍一定的时间。渍一定的时间。 真空负压浸蜡法真空负压浸蜡法 将透明好的组织放入浸蜡缸中，然后将透明好的组织放入浸蜡缸中，然后 移入真空负压箱内，或者脱水机自身配有移入真空负压箱内，或者脱水机自身配有 的真空负压装置进行浸蜡。的真空负压装置进行浸蜡。 浸蜡时间，真空负压数见表。浸蜡时间，真空负压数见表。 常规病理学技术77 组组织织分分类类、浸浸蜡蜡时时 间间、浸浸蜡蜡方方

49、法法 鼻鼻咽咽部部、宫宫内内 膜膜、穿穿刺刺物物、 排排出出物物 甲甲状状腺腺、肝肝、肾肾、 淋淋巴巴结结等等 子子宫宫肌肌、 平平滑滑肌肌、 胃胃、肠肠、大大块块的的 组组织织、横横纹纹肌肌 所所需需温温度度 传传统统浸浸蜡蜡法法 6090min 90150min 180min 以以上上 65 真真空空负负压压浸浸蜡蜡法法 1520min 2530min 60min 以以上上 65以以上上 真真空空负负压压压压力力读读数数 26.733.3Kpa 4053.3Kpa 66.7Kpa 以以上上 真空负压浸蜡时间压力表 注：注：1 1、计时应以石蜡全部溶化时计起。、计时应以石蜡全部溶化时计起。

50、2 2、当抽气时，温度应调高几度，至抽气完成后、当抽气时，温度应调高几度，至抽气完成后 才调至所需温度。才调至所需温度。 常规病理学技术78 （四）组织包埋（四）组织包埋 将浸完蜡的组织埋葳于石蜡中的过程称为将浸完蜡的组织埋葳于石蜡中的过程称为 组织包埋。组织包埋。 包埋时的注意事项：包埋时的注意事项： 1 1、所使用的镊子，包埋框，最好放于、所使用的镊子，包埋框，最好放于3737的恒温的恒温 箱内，以免这些物质过冷（在冬天时）而过箱内，以免这些物质过冷（在冬天时）而过 早冷却包埋的石蜡，影响包埋的质量，这种早冷却包埋的石蜡，影响包埋的质量，这种 现象在没有石蜡包埋机的单位较为明显。现象在没有

51、石蜡包埋机的单位较为明显。 常规病理学技术79 2 2、打开脱水盒，取出组织块，将一平整的大的、打开脱水盒，取出组织块，将一平整的大的 一面朝下，并用镊子压平，使其保持在一水一面朝下，并用镊子压平，使其保持在一水 平面上。平面上。 3 3、每包埋完一块，应附上标签，以免出差错或、每包埋完一块，应附上标签，以免出差错或 张冠李戴。如为塑料包埋盒，则可少去这一张冠李戴。如为塑料包埋盒，则可少去这一 步，极为方便。步，极为方便。 4 4、对于管腔的组织如血管、肠、气管等应竖起、对于管腔的组织如血管、肠、气管等应竖起 来包埋对于皮肤及胃、肠、等组织应辩认好来包埋对于皮肤及胃、肠、等组织应辩认好 方向。

52、仔细包埋。方向。仔细包埋。 常规病理学技术80 5 5、细小多块的组织，可包埋在一个蜡块，、细小多块的组织，可包埋在一个蜡块， 但应保持在同一平面上，以免影响切但应保持在同一平面上，以免影响切 片。片。 6 6、包埋完后，蜡面凝固，便可放入水中加、包埋完后，蜡面凝固，便可放入水中加 速硬化，如带有冷冻设备的包埋机，速硬化，如带有冷冻设备的包埋机， 则可少去这一步。则可少去这一步。 常规病理学技术81 7 7、包埋时组织块不能使其冷却凝固，应、包埋时组织块不能使其冷却凝固，应 保持组织块上的蜡处于熔化状态，这保持组织块上的蜡处于熔化状态，这 样包埋时才能和包埋蜡溶为一体。如样包埋时才能和包埋蜡溶

53、为一体。如 果组织块自身的蜡先凝固，包埋后的果组织块自身的蜡先凝固，包埋后的 蜡块切片时组织与边蜡分离切不成佳蜡块切片时组织与边蜡分离切不成佳 片严重的会崩掉，影响切片。片严重的会崩掉，影响切片。 常规病理学技术82 （五）修切蜡块（五）修切蜡块 应用包埋框包埋的组织块，切片前一定应用包埋框包埋的组织块，切片前一定 要将其切好，组织块与边蜡应保持有要将其切好，组织块与边蜡应保持有0.50.5cmcm的的 厚度，才有利于切片。厚度，才有利于切片。 1 1、有利于切片，使切片能连续切出。、有利于切片，使切片能连续切出。 2 2、减少损伤刀口延长刀口的寿命，以利多切蜡、减少损伤刀口延长刀口的寿命，以

54、利多切蜡 块。块。 3 3、有利于切片的裱贴。例如一张载片要裱两块、有利于切片的裱贴。例如一张载片要裱两块 组织时，修切好的蜡块，就能使它们摆得整组织时，修切好的蜡块，就能使它们摆得整 齐。齐。 常规病理学技术83 （六）切片和裱片（六）切片和裱片 在操作时的注意事项：在操作时的注意事项： 1 1、持蜡器一定要将蜡块挟紧挟牢，以免使、持蜡器一定要将蜡块挟紧挟牢，以免使 其跳动而影响切片。其跳动而影响切片。 2 2、刀一定要保持无口、锋利，一次性刀片、刀一定要保持无口、锋利，一次性刀片 做到这一点较容易，大刀片要做到上述做到这一点较容易，大刀片要做到上述 要求就比较困难。因此就要认真地磨好要求就

55、比较困难。因此就要认真地磨好 刀才能保证切片的质量。刀才能保证切片的质量。 常规病理学技术84 3 3、裱片的水温不能过高或偏低，高者可溶、裱片的水温不能过高或偏低，高者可溶 化所切出的切片，低者则展不开切片，化所切出的切片，低者则展不开切片， 使切片留有皱纹，最适的水温应是比石使切片留有皱纹，最适的水温应是比石 蜡的溶点低蜡的溶点低2-52-5，如石蜡的溶点为，如石蜡的溶点为60-60- 6262，裱片的水温则可达，裱片的水温则可达55-5755-57，余，余 者类推。者类推。 4 4、对于细小的组织，应特别小心修切，防、对于细小的组织，应特别小心修切，防 止一刀切下，全部皆休的情况。止一刀

56、切下，全部皆休的情况。 常规病理学技术85 5 5、对于多块细小的组织，原则上是每一细、对于多块细小的组织，原则上是每一细 小的组织都应有一个切面。修切的时候小的组织都应有一个切面。修切的时候 更应特别小心。更应特别小心。 6 6、每切完一块，裱于载片后应随时刻上编、每切完一块，裱于载片后应随时刻上编 号，以防止差错或混乱的现象发生，减号，以防止差错或混乱的现象发生，减 少差错的苗头。少差错的苗头。 7 7、挑切片的毛笔，应选用细小柔软的毛笔、挑切片的毛笔，应选用细小柔软的毛笔 为佳，用时向上挑，决不能往下，以免为佳，用时向上挑，决不能往下，以免 刀口伤及毛笔。刀口伤及毛笔。 常规病理学技术8

57、6 石蜡切片常可出现的问题石蜡切片常可出现的问题 1、石蜡切片不能形成带状的原因是室温低，蜡、石蜡切片不能形成带状的原因是室温低，蜡 块周边不整齐。块周边不整齐。 2、石蜡切片，切片卷起的原因是刀的倾斜角度、石蜡切片，切片卷起的原因是刀的倾斜角度 过大或刀不快。过大或刀不快。 3、石蜡切片出现的皱折的原因是石蜡溶点低，、石蜡切片出现的皱折的原因是石蜡溶点低， 纯度不足。纯度不足。 4、石蜡切片出现厚薄不均匀的主要原因是组织、石蜡切片出现厚薄不均匀的主要原因是组织 块挟不牢固或组织坚硬如肌瘤等。块挟不牢固或组织坚硬如肌瘤等。 常规病理学技术87 5、石蜡切片出现波浪状的原因是组织块太、石蜡切片出

58、现波浪状的原因是组织块太 硬或骨组织末完全脱钙。硬或骨组织末完全脱钙。 6、石蜡切片，当切片放入水中裱片时，切、石蜡切片，当切片放入水中裱片时，切 片周围的蜡迅即向四边散开，其主要片周围的蜡迅即向四边散开，其主要 原因是组织脱水不彻底，浸蜡浸不进原因是组织脱水不彻底，浸蜡浸不进 去。包埋蜡中含有二甲苯。去。包埋蜡中含有二甲苯。 7、石蜡切片，当切片切出后蜡块向上时，、石蜡切片，当切片切出后蜡块向上时， 把已切出的切片带走并损坏的原因是把已切出的切片带走并损坏的原因是 切片刀背面留有残余石蜡。切片刀背面留有残余石蜡。 常规病理学技术88 8 8、组织切片常见的人为性色素沉着物是福、组织切片常见的

59、人为性色素沉着物是福 尔马林色素，常见的器官是肝、脾。尔马林色素，常见的器官是肝、脾。 9 9、组织切片常见的外源性色素是碳末，常、组织切片常见的外源性色素是碳末，常 见的器官是肺。见的器官是肺。 1010、石蜡切片时切片刀的最宜角度是、石蜡切片时切片刀的最宜角度是 5-30 5-30 1111、一般所称呼的标准室温是、一般所称呼的标准室温是2020 1212、组织浸蜡的温度最好为、组织浸蜡的温度最好为 1212、石蜡溶点的最高度高、石蜡溶点的最高度高2-32-3即即6565。 常规病理学技术89 （七）石蜡切片的烘烤（七）石蜡切片的烘烤 石蜡切片在染色前，为了防止脱落，石蜡切片在染色前，为了

60、防止脱落， 都必须进行烘烤，以促进切片附贴的牢固都必须进行烘烤，以促进切片附贴的牢固 性。性。 1 1、常规切片烘烤、常规切片烘烤 常规石蜡切片切完后，在常规石蜡切片切完后，在6060的烤箱的烤箱 中烘烤中烘烤20-3020-30minmin便可进行染色。便可进行染色。 常规病理学技术90 2 2、免疫组化切片的烘烤、免疫组化切片的烘烤 应用于免疫组化染色的切片，由于整应用于免疫组化染色的切片，由于整 个过程都在冲冲洗洗中进行，因此要求切个过程都在冲冲洗洗中进行，因此要求切 片附贴要十分牢固，以免脱片，烘烤切片片附贴要十分牢固，以免脱片，烘烤切片 的时间可为的时间可为1 1h h、1.5h1.