Real_timePCR技术在食物中毒副溶血性弧菌快速检测中.

1、2010年第10卷第11期论著细菌性食物中毒是常见的突发公共卫生事件，食物中毒事 件病原菌的快速检测 是疾病预防控制工作的重要内容 。实时荧 光定量PCR技术（Real-time PCR在 PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR过程，最后通 过标准曲线对未知模板进行定量分析1,具有灵敏度高、特异性强的技术特点， 近年来在生物因子导致的突发公共卫生事件病原学诊断中得到广泛应用。将传统的微生物检验技术与Real-time PCR技术联合应用于病原微生物检测工 作,有利于分子生物学技术的实际应用和推广。现就一起食物中毒事件处 理中应 用Real-time PCR技术快速

2、检测副溶血性弧菌的结果报告如下。1材料与方法1.1材料1.1.1仪器M INI OPT ICON 实时荧光定量 PCR仪（美国BIORAD公司；VIT EK 2-COM PACT全自动细菌鉴定药敏分 析仪及GN细菌生化鉴定卡（法国生物梅 里埃公司。1.1.2培养基及试剂CHROM agar弧菌显色分离培养基（郑州安图公司，营养肉 汤、3.5%氯化钠碱性胨水、哥伦比亚血琼 脂平板、革兰氏染色液（北京陆桥公 司、氧化酶试剂（美国BD公司。副溶血弧菌Real-time PCR检测试剂盒（广州中 山达安基因生物公司。以上试剂均在有效期内使用。1.1.3样本来源2008年9月16日23时，接柳州市食源性

3、疾 监测哨点医院一柳 州市第三人民医院报告：柳州铁路运输学校 有20多名学生食用同学自北海市家中带 来的海虾和贝类后26h发生恶心、呕吐、腹痛、腹泻症状陆续到该院就诊，怀 疑细菌性食物中毒。柳州市疾病预防控制中心突发事件应急处理小组及时开展了现场流调，因为没有剩余食物，未采到食剩的海虾 贝类,仅对4位住院学生采集肛拭 子送实验室检验食源性致病菌。1.2方法1.2.1样本处理 根据流调结果和患者发病前共同进食的食物特点和发病症状，对肛拭子开展副溶血性弧菌检测。121.1增菌前样本处理 将肛拭子样本置3.5%氯化钠碱性 胨水中用微型振荡器 振荡30s洗脱肛拭子上附着粪便样本与 增菌培养基混匀,从中

4、取约0.5ml置4C冰 箱保存。此为增菌前 样本液,4份增菌前样本液编号为080916a、080916b、 080916c、 080916d。1.2.1.2样本增菌液制备 参照WS/T271-20072分别用3.5%氯化钠碱性胨水对 样本增菌6h后制得样本增菌液，采用Real-time PCR技术和细菌培养分离与仪器鉴 定试验技术同时 进行检测。4份增菌后的样本增菌液编号为 080916A、080916B、080916C、080916D。1.2.2Real-time PCR 检测试验1.2.2.1核酸提取 取每份增菌前样本液和样本增菌液各 50卩加入副溶血弧菌荧 光定量PCR检验试剂盒配套的核

5、酸提 取试剂50卩l混匀置100C裂解10min后, 12000转/min分高 速离心5min,取上清液2卩作为模板用于Real-time PCR检测 副 溶血性弧菌核酸。1.2.2.2Real-time PCR检测副溶血性弧菌核酸采用M INIReal-time PCR技术在食物中毒副溶血性弧菌快速检测中的应用陈柳军，秦景新,邹碧,余钧池,蒙晓辉摘要：目的介绍实时荧光定量PCR(Real-timePCR技术快速食物中毒检测的应 用。方法运用Real-time PCR检验技术对增菌前后的食物中毒事件样本检测副溶 血性弧菌的保守基因片段。结果Real-time PCR检验技术对增 菌后的样本检测

6、到 的副溶血性弧菌核酸的荧光强度均高于增菌前的样本，证实样本增菌后目标菌生长 繁殖,样本中存 在具有生物学活性感染力的副溶血性弧菌。结论在食物中毒致病 菌的筛查确证工作中，与传统微生物检验技术相 结合的Real-time PCR技术值得应 用和推广。关键词:细菌性食物中毒；实时荧光定量PCR ;快速诊断中图分类号：R155.3+1文献标识码:A文章编号：1009-9727(2010 11-1308-02Applicati on of real-time PCR in rapid diag no sis of pathoge ns of food pois oning. CHEN Liu-jun

7、 , QIN Jing-xin , ZOU Bi , et al. (Liuzhou Municipal Center for Disease Con trol a nd Preve ntion , Liuzhou 545007, Gua ngxi , P.R.Chi naAbstract :Aim To in troduce the real -time PCR tech no logy for rapid diag no sis of food pois oning pathoge ns. Methods Real-time PCR tech no logy was employed fo

8、r rapid detect ion food pois oning bacteria before and after bacterium en richme nt and amplificati on of gene fragme nts of Vibrio parahaemolyticus. Results The fluoresce nee in ten sity of real-time PCR tech no logy higher in rapid detect ion of Vibrio parahaemolyticus after bacterium en richme nt

9、 tha n before bacterium en richme nt. Con clusi ons Real-time PCR tech no logy is suiable for rapid diag no sis of food pois oning pathoge ns.Key words :Bacterial food pois oning , Real-time PCR , Pathoge ns , Rapid diag no sis基金项目：广西卫生厅立项课题(项目编号:Z2008383作者单位：柳州市疾病预防控制中心，广西柳州545007作者简介:陈柳军(1966 ,汉族,

10、医学学士 ,主管技师,主要从事微生物检验和实 验室管理工作1308中国热带医学2010年第10卷第11期CHINA TROPICAL M EDICINEVol.10No.11Novem ber 2010OPT ICON实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增和结果分析处理。据试剂盒使用说明书设置PCR条件:反应体系为25卩I，其中Real-time PCR反应液17.0卩I , T aq聚合酶3.0卩l模板2.0卩l , ddH 2O 3.0。循环条件为94C变性3min后，93C 30s , 55C 45s扩增40个循环。仪器检测和分析标记荧光。1.2.3细菌培养分离与仪器鉴定试验1.2.3.1细

11、菌培养分离 取样本增菌液接种CHROM agar弧菌显色分离培养基，36.5C培养20h后挑取培养基上紫红色可疑 目的菌落接种哥伦比亚血琼脂平板纯 培养,36.5C培养20h后取平板上培养物做革兰氏染色镜检,同时做氧化酶试验。1.2.3.2菌悬液制备 分别来自4份样本的可疑菌落在哥伦比 亚血琼脂平板上纯培养 物革兰氏染色镜检结果均为革兰氏阴性短小杆菌，氧化酶试验均为阳性。取培养 物与0.85%NaCI配成0.5麦氏单位菌悬液填充 GN细菌生化鉴定卡,用VIT EK 2 COM PACT全自动细菌鉴定药敏分析仪检测鉴定 。2结果2.1实时荧光定量 PCR检测结果 M INI OPT ICON实时

12、荧光 定量PCR仪在上样2h后对4份增菌前样本液和4份样本增菌 液的检测结果荧光强度曲线图均显示检出副溶血弧菌DNA，但样本增菌后的荧光强度明显高于样本增菌前（样本增菌前后Real time PCR检测结果荧光强度曲线见图1 , Ct值则相反,说明样本增菌后其中 存在的副溶血性弧菌有生长繁殖现象，从而证明样本中存在具有生物学活性感染力 的副溶血性弧菌。图14份样本增菌前后Real time PCR检测结果荧光强度曲线2.2细菌培养分离与仪器鉴定试验结果 填充菌液后GN细菌生化鉴定卡置VITEK 2 COM PACT全自动细菌鉴定药敏分 析仪检测箱中,仪器按程序开展检测工 作。上机4h后细菌鉴定

13、 仪报告检测结果，4份样本均检出副溶血性弧菌，%id为 99% （很好的鉴定。2.34份肛拭子检验结果报告：均检出副溶血性弧菌3讨论虽然本次事件调查没有剩余食物检验结果的旁证，只有疑似食物中毒患者的肛 拭子样本检出副溶血性弧菌，但根据食物中毒流行病学特点、临床症状、副溶血 性弧菌的生物学特性等，可以判断该事件是一起食用了副溶血性弧菌污染的海产品 引起的食物中毒。副溶血性弧菌是主要的食源性致病菌之一，其引发的食物中毒在南方地区经常发生。传统的细菌鉴定方法存在中间环节多、速度 慢、准确性差、时效性明显不能满足检测快速及时要求的缺陷3,如食品污染副溶血性弧菌检测鉴定通常需要经过增菌、选择性分离、目的

14、菌纯培养、生化 试验和血清凝集试验鉴定 确认等步骤，操作繁琐,耗时一般为57d ,甚至更长时 间。使用全自动细菌鉴定仪检测鉴定细菌，缩短了生化试验时间，但该仪器需根据 细菌革兰氏染色镜检和氧化酶试验结果选择仪器配套生化鉴定卡开展以生化反应结果为依据的细菌鉴定工作，无法节省目的菌分纯培养的一系列实验工作，对食品污 染副溶血性弧菌检测鉴定约需23d。 Real-time PCR检验技术对食品 污染副溶血 性弧菌的鉴定，由于特殊的检测工作原理，无需针对细菌纯培养物进行鉴定，样本采 集后34h内就能检测出样 本是否存在副溶血性弧菌的典型基因片段。但由于PCR技术主要针对生物因子核酸片段检测而言，检测结

15、果得不到可以进行 活体保 存的病原体开展研究工作4,从而无法确定检测到的核酸片段是否来源于具有生 物学活性和感染力的病原菌，对于证实感染食源性致病菌引发食物中毒不能直接举 证,因此检验结果有时不能作为公共卫生突发事件病原学诊断依据。为了证实样本中确实存在具有生物活性感染 力的致病菌，必须将Real-time PCR技术与传 统微生物检验技术相结合，通过适当 的增菌方式繁殖样本中的检测目的菌后，对增菌 前后的样本同 时运用Real-time PCR技术检测目的菌核酸。由于核酸扩增指 数期 取决于PCR模板的相对量，原始模板越多，达到指数扩增期所需的扩增循环周期数 (Ct值越少5,如果目的菌增菌后

16、的 核酸模板在PCR达到指数循环时的Ct值低于 增菌前的核酸模板在PCR达到指数循环时的Ct值，表明增菌后的核酸原始模板量 高于增菌前的核酸原始模板量，即细菌通过增菌得到增 殖,则可以证实该病原体是具 有生物活性的病原菌。本次食物中毒事件处理，由于流行病学调查结果倾向于副溶血性弧菌是导致本 次事件发生的主要致病微生物，因此实验室检测忽略其他食源性致病菌的检测。在流行病学证据很难支持判断引发事件的病原生物因子范畴时，应加大食源性致病 生物因子的检测范围,而Real-time PCR检测技术操作手续简单、诊断时间耗时 短、灵敏度高、特异性强的先进技术优势表现更加明显。因此，在食物中毒致 病菌的筛查确证工作中,与传统微生物检验技术相结合的Real-time PCR技术值得 应用和推广。参考文献：1赵焕英，包金凤实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进 展J .中国 组织化