省教育厅科学研究项目2

1、省教育厅编号项目类别理工类农林医类一般人文社科类省教育厅科学研究项目申 请 书项 目名 称：SARS冠状病毒感染免疫学快速诊断试剂盒的研制申 请 者：所 在 单 位：电 话：传 真：电子信箱 (Email):申 请 日 期：2002年制填 报 说 明 一、申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。除签名外，项目申请书必须是打印件。 二、申请书一律用A4纸，于左侧装订成册。第二页起各栏空格不够时，请自行加页。 三、封面上“教育厅编号”由教育厅填写，“项目类别”在相应的位置填写“重点”、“青年”、“一般”。 （封2）一

2、、 简表项目名称SARS冠状病毒感染免疫学快速诊断试剂盒的研制类别基础研究应用研究一般试验发展研究年限 2003年5月 至 2004 年6月申请经费 14万元项 目负责人姓名年龄 48技术职务 教授已获学位硕士所学专业 病原生物学现从事专业 病原生物学主要研究人员姓 名年龄技术职务已获学位专业 签名30讲师硕士病原生物学30讲师硕士病原生物学28助教硕士临床检验33高级实验师硕士卫生检验37副教授硕士病原生物学 57教授本科病原生物学主要研究内容本研究拟通过生物信息学软件分析并寻找我国分离SARS冠状病毒株的S蛋白和M蛋白基因共同的保守序列，RT-PCR扩增该基因，克隆至真核表达载体，在哺乳动

3、物细胞中表达，用纯化蛋白抗原制备的单克隆抗体来制备免疫金复合物，开发斑点免疫层析试纸条检测病毒的相应抗原；同时将纯化的抗原包被微孔板，用间接法酶联免疫吸附试验检测患者血清中的相应抗体，二者互为结合用于SARS冠状病毒感染的早期诊断。本研究将为基层医疗机构诊断SARS冠状病毒感染提供准确、特异、快速、方便、价廉的诊断试剂，为控制SARS冠状病毒在地级以下城市及广大农村的传播和感染提供有力的工具。是否我厅在建重点学科，学科名称：否1二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析） 自2002年末在我国广东省发现首例非典型肺炎病例以来，该疾病至今已经广泛扩散到香港、越南、东南亚及加拿大和美国

4、等近30个国家和地区，至5月2日世界卫生组织（WHO）统计全球患者已多达6054 多例，且发病人数仍有不断增加的趋势1。该病主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播，起病急、传播快，病死率高达10，WHO将这种传染病称为重症急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS）。中国香港和大陆、加拿大、美国等国家的研究机构病原学调查研究表明引起该病的病原体是冠状病毒家族的一个新的变种，命名为SARS冠状病毒2，3，4，5。冠状病毒是引起人类上呼吸道感染的病原，其感染在全世界各个地区广泛分布，主要发生在冬季和早春季节，通常引起成人的普通感冒，也是成人慢性气管炎

5、患者急性加重的重要病原。冠状病毒分三个组群，组群1和2包括哺乳动物病毒，而组群3仅包括禽类病毒。人冠状病毒分别属于组群1和2，有OC43和229E两个抗原型，引起约30%中度上呼吸道感染疾病。SARS冠状病毒也是一种单正链RNA病毒，但研究结果表明该病毒是一个新的病毒变种：SARS冠状病毒可在Vero细胞中生长；病毒编码的制酶基因和S、E、M、N蛋白四基因的聚类分析表明该病毒和已知的三个组群有明显差别；用已知的冠状病毒抗原检测不到患者恢复期血清中的抗体2。SARS冠状病毒感染具有很高的传染性和较高的死亡率，而且目前尚无特异性治疗和预防手段，因此迫切需要早期诊断以控制传染源和切断传播途径，减少对

6、易感人群的危害。对SARS冠状病毒的早期诊断主要包括细胞培养方法分离病毒、逆转录PCR扩增病毒的RNA、血液中抗体检测等三种6。病毒的细胞培养是诊断该病的金标准，但培养要求高，生长时间长，阳性率很低，不适于早期诊断。逆转录PCR 具有高敏感性和特异性的优点，可以在感染后1到2天检测体内的病毒，虽然可以辅助临床诊断，但是病毒RNA提取困难、易降解，容易出现假阴性结果；且操作易污染，容易出现假阳性结果。抗体检测有间接免疫荧光和酶联免疫吸附试验（ELISA）两种，前者可以检测出病毒感染10天后产生的 IgM型抗体,后者可以可靠地检出感染14-21天后SARS病人血清中的病毒抗体（IgM/IgG），但

7、这两种方法都不能用于早期诊断。细胞培养、RT-PCR和间接免疫荧光试验均需要特殊的设备和条件，且操作人员需要专业培训并具备一定的经验，因此在广大基层很难推广，这对于地级以下的城市和广大农村预防SARS带来很多不便，因此开发一种简单、方便、廉价的诊断试剂有非常重要的实用价值并且有很大的市场前景。快速斑点免疫层析试验(dot immunochromatographic assay, DIBA)是一种免疫胶体金测定方法7，使用硝酸纤维膜作为载体，利用微孔膜的毛细作用，使滴加在试纸条一端的标本向另一端渗移，途中与胶体金复合物结合，出现颜色变化。该技术从80年代问世以来一直受到检验人员的重视，其技术发展

8、很快，从药物的测定到传染病病原抗原、抗体检测，激素和肿瘤标志物检测等，应用范围日益扩大。斑点免疫层析试验由于其快速、操作简便、不需特殊设备、且可单份测定，可以用于早期诊断SARS病毒的感染，符合基层医疗结构的需要。本研究拟建立用于检测SARS冠状病毒的S蛋白和M蛋白抗原的斑点免疫层析试验，同时建立相应的诊断血清中S蛋白和M蛋白抗体的酶联免疫吸附试验方法，二者互为补充来诊断SARS 冠状病毒的感染。参考文献：1. Cumulative Number of Reported Probable Cases of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS). ht

9、tp://csr/sarscountry/2003_05_02/en/2. Rota PA ，Oberste MS，Monroe SS, et al. Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute RespiratorySyndromehttp:/ / 1 May 2003 / Page 1/ 10.1126/science.10859523. Peiris J, Lai S, Poon L, et al. Coronavirus as

10、a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet, 2003, 361(9366):1319-1325 4. Poutanen SM, Low DE, Henry B, et al.Identification of severe acute respiratory syndrome in Canada. N Engl J Med 2003;3485. Ksiazek G, Erdman D, Goldsmith CS , et al. A Novel Coronavirus Associated with Severe

11、 Acute Respiratory SyndromeThomas .N Engl J Med 2003;348 6. 中国生物信息网. SARS病毒的背景和初步分析. 7. 陶义训. 金免疫技术. 陶义训主编: 免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社，p174-184 三、研究方案1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：1）建立斑点免疫层析试验检测SARS冠状病毒抗原2）建立酶联免疫吸附试验（ELISA）检测SARS冠状病毒抗体研究内容：1）基因序列比较分析GeneBank中我国SARS病毒分离株刺突糖蛋白（S蛋白）和小膜蛋白（M蛋白）基因的保守序列，设计特异性引物。2）逆转录聚合酶

12、链反应（RTPCR）扩增抗原保守序列，克隆至T载体，再亚克隆至Psv2-EP真核表达载体，转染哺乳动物细胞，表达蛋白、纯化蛋白。3）纯化蛋白抗原免疫动物，杂交瘤技术制备单克隆抗体，纯化及鉴定单克隆抗体。4）用单克隆抗体制备免疫金复合物，制成斑点免疫层析试验试纸条（双抗体夹心法），测试其灵敏度和特异性；将纯化蛋白抗原包被微孔板，用ELISA间接法检测SARS病毒S蛋白和M蛋白的抗体，测试其检测敏感性和特异性。5）临床试验检测评估其质量，批量制备试剂盒。拟解决的关键问题:1) 体外表达出具有完整抗原性的SARS冠状病毒S蛋白和M蛋白2）改进斑点免疫层析试验和酶联免疫吸附试验的敏感性和特异性2. 拟

13、采取的研究方法及可行性分析研究方法：1）病毒培养：Vero E6细胞在含10新生小牛血清的1640培养基内37培养4872h，长成单层后即可感染SARS冠状病毒株。感染病毒后在33继续培养，观察细胞病变，出现细胞变圆、肿胀、成堆、脱落现象者，70冷冻保存。2）序列分析：应用ClustalW分析下列SARS冠状病毒株基因的S蛋白和M蛋白序列，选择保守区域：SARS coronavirus BJ01 ；SARS coronavirus BJ02；SARS coronavirus BJ03；SARS coronavirus BJ04；SARS coronavirus CUHK-W1；SARS cor

14、onavirus GZ01；SARS coronavirus HKU-39849；SARS coronavirus Hong Kong/03/2003；SARS coronavirus Taiwan；SARS coronavirus Tor2；SARS coronavirus Urbani；SARS coronavirus Vietnam。3）RT-PCR：以Primer5.0在靶基因保守区域两端设计引物，提取细胞培养物中的病毒RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增特异性保守序列，产物T-A克隆至T载体，再亚克隆至Psv2-EP真核表达载体，电穿孔法转染细胞，筛选G418抗性细胞表达蛋白，分离纯

15、化蛋白。4）细胞融合及制备单克隆抗体：将纯化的蛋白抗原免疫小鼠，加强免疫后处死，取脾脏制备脾细胞悬液，加入PEG和骨髓瘤细胞悬液混合，置于含HAT选择培养基的微孔板中培养，筛选阳性细胞建株，制备单克隆抗体，纯化并鉴定单克隆抗体。5）胶体金和免疫金制备：取100ml 0.01氯金酸（HAuCl4 ）加热至沸，搅动下加入2ml 1柠檬酸三钠水溶液继续加热煮沸15min，冷至室温后用蒸馏水补足100ml即为胶体金溶液。取调节胶体金溶液pH 到8.0，加入1/10体积5纯化抗原蛋白溶液，放置室温反应25min,加入0.2 PEG 饱和游离的胶体金，离心去除未结合的蛋白质。沉淀用PBS悬浮，离心洗涤，反

16、复3次，用稀释液配制终浓度为0.5免疫金溶液。6）斑点免疫层析：取6mm70mm塑料板条，在上端和下端分别粘贴吸水材料，将吸附免疫金的干片贴于近下端，紧贴其上为硝酸纤维素膜条（免疫金干片侧为检测区，包被有特异抗体；近上端为参照区，包被有抗小鼠IgG。检测病毒时将板条下端浸入标本中，待液体向上端移动，检测带和参照带均为红色线条者为抗原阳性。7）酶联免疫吸附试验：将纯化的S蛋白或M蛋白抗原包被到聚苯乙烯微孔，过夜，PBS洗涤除去游离的蛋白质。微孔加待检血清50l，孵育30min后，加入50l HRP标记的羊抗人IgG，孵育30min洗涤液洗涤5次，拍干后加入50l H2O2和邻苯二胺避光显色10m

17、in后，酶标仪测OD值，判断结果。8）敏感性和特异性检测：系列稀释已知含量的病毒抗原，检测斑点免疫层析试纸条的敏感性；应用冠状病毒科的成员人冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫肠道冠状病毒、狗冠状病毒、牛冠状病毒、兔冠状病毒、大鼠涎腺炎病毒、鼠肝炎病毒、火鸡冠状病毒、禽传染性支气管炎病毒等检测斑点免疫层析试纸条的特异性；系列稀释已知含量的病毒抗体，检测ELISA的敏感性，应用冠状病毒科成员的抗体检测其特异性。可行性分析：1）斑点免疫层析试验和酶联免疫吸附试验已经成功地用于免疫学临床检验，技术成熟。2）3) 申请者所在单位具备从事本项研究所

18、需要的设备和条件。研究优势:学校领导对科研工作极为重视，把搞好科研工作作为振兴学校的关键，对于获得的课题学校将从政策、经费、人员和场地等方面予以大力支持。研究工作起步早技术成熟，具备相关设备。医院检验科、深圳市人民医院检验科建立广泛关系，有病原体临床检测室，对该项目开展具备相应条件。且与在美国得克萨斯工作的钟光明教授有科研协作，对此项研究的科研试剂与技术关键具备了有利条件。3本项目的创新之处目前对SARS冠状病毒感染的实验室诊断方法主要为细胞培养分离病毒，RT-PCR扩增RNA，和间接免疫荧光检测抗体，但这些试验均需要特殊设备和熟练的专业人员，且试验费用昂贵，不能推广到基层应用。我们开发的斑点

19、免疫层析试验检测试剂盒可用于感染的早期诊断，具有准确、特异、快速的特点，且操作简便、不需特殊设备、可单份测定，还可用于患者自检，因此有着广泛的应用前景和广阔的市场空间。4. 预期的研究进展和成果 预期的研究进展：2003.052003.06 分析基因序列，设计引物，培养病毒2003.072003.10 RT-PCR扩增靶基因，构建表达载体，表达并纯化抗原2003.112003.12 制备单克隆抗体2004.012004.04 制备斑点免疫层析板条和ELISA微孔板，检测试验的灵敏度和特异性2004.052004.06 临床试验评估，批量生产试剂盒预期的成果：成功制备斑点免疫层析和酶联免疫吸附试剂盒用于临床诊断SARS冠状病毒的感染，并可培养硕士研究生2到3名，发表论文3到4篇。四、研究基础五、经费预算支 出 科 目金 额（万元）计 算 根 据 及