生物环境工程实验指导

1、生物环境工程实验生物环境工程 实验指导生命科学与工程学院目 录实验一 生化需氧量(BOD5)的测定 4学时实验二 固定化酵母细胞对Cr6+的生物吸附 5学时实验三 酚降解菌的筛选 2学时实验四 酚降解菌的分离 2学时实验五 酚降解菌对酚的降解能力测定 3学时实验六 氧化亚铁硫杆菌脱除煤炭中的无机硫 5学时实验一 生化需氧量(BOD5)的测定一、实验目的1、掌握稀释法测定BOD5的原理和方法。2、掌握碘量法测定水中溶解氧含量的原理和方法。二、实验原理生化需氧量是指在规定的条件下，微生物分解水中的某些可氧化的物质，特别是分解有机物的生物化学过程消耗的溶解氧。稀释法测定BOD5是将水样经过适当稀释后

2、，使其中含有足够的溶解氧供微生物5d生化需氧的要求，将此水样分成两份，一份测定培养前的溶解氧；另一份放入20恒温箱内培养5d后测定溶解氧，两者的差值即为BOD5。测定水中的溶解氧是利用硫酸锰在碱性溶液中生成二价锰的氢氧化物，二价锰的氢氧化物被水中溶解氧氧化成四价锰，并生成氢氧化物沉淀，而在酸性溶液中，氢氧化物沉淀生成四价锰化合物，其将KI氧化而析出I2。析出I2的摩尔数与水中溶解氧的当量数相等，因此可用硫代硫酸钠的标准溶液滴定。根据硫代硫酸钠的用量，计算出水中溶解氧的含量。其反应式如下。MnSO4+2NaOHMn(OH)2(白色) + Na2SO42Mn(OH)2 +O22MnO(OH)2(棕

3、色)MnO(OH)2+2H2SO4Mn(SO4)2 +3H2OMn(SO4)2 +2KIMnSO4+I2+K2SO4I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6三、实验器材与试剂1、样品污水处理厂生物处理排放水2、器材恒温培养箱（201），5-20L细口玻璃瓶，碘量瓶，移液管，滴定管，1000-2000mL 量筒，容量瓶，抽气泵，虹吸管，特制搅拌棒（在玻璃棒下端安装一个2mm厚，大小和量筒相匹配的有孔橡皮片）。3、试剂K2HPO4，KH2PO4，Na2HPO47H2O，NH4Cl，MgSO47H2O，CaCl2，FeCl36H2O，HCl，NaOH， MnSO44H2O，KI，K2Cr2O7

4、，H2SO4，Na2CO3，可溶性淀粉，pH试纸。（1）磷酸盐缓冲溶液：将0.85g KH2PO4，2.175g K2HPO4，3.34g Na2HPO47H2O和 0.17g NH4Cl溶于一定量的蒸馏水中，定容至100mL。此溶液的 pH 值应为 7.2。 （2）MgSO4溶液：将2.25g MgSO47H2O溶于一定量的蒸馏水中，定容至 100mL。（3）CaCl2溶液：将 2.75g CaCl2溶于一定量的蒸馏水中，定容至 100mL。 （4）FeCl3溶液：将 0.13g FeCl36H2O溶于一定量的蒸馏水中，定容至500mL。（5） 0.5mol/L HCl溶液：将4 mL（=1

5、.18g/ mL）HCl溶于一定量的蒸馏水中，定容至 100mL。（6）0.5mol/L NaOH溶液：将 2g NaOH溶于一定量的蒸馏水中，定容至100mL。（7）MnSO4溶液：称取48g MnSO44H2O溶于30-40mL蒸馏水中，若有不溶物，应过滤，定容至100mL。（8）碱性KI溶液：称取50g NaOH溶于30-40mL蒸馏水中，冷却；另称取15g KI溶于20mL蒸馏水中；将两种溶液混合均匀，并定容至100mL。如有沉淀，则放置过夜后，倾出上清液，贮于棕色瓶内，用橡皮塞塞紧，避光保存。此溶液酸化后，遇淀粉应不呈蓝色。（9）1%淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉，用少量水调成糊状，然

6、后加入刚煮沸的100mL水（也可加热1-2min）。冷却后加入0.1g水杨酸或0.4氯化锌防腐。（10）K2Cr2O7标准溶液（1/6K2Cr2O7=0.025mol/L）：称取1.2258g在105110烘干2h的K2Cr2O7，溶解后转入1000mL容量瓶内，用水稀释至刻度、摇匀。（11）（1+5）H2SO4：将1份体积的H2SO4，慢慢滴加到5份体积的水中，边滴加边搅拌。（12）0.025mol/L Na2S2O3溶液：称取6.25g Na2S2O35H2O，溶于经煮沸冷却的水中，加入0.2g Na2CO3，稀释至1000mL，储于棕色试剂瓶内，使用前用0.0250mol/L K2Cr2

7、O7标准溶液标定。四、实验步骤1、水样的采集、存储和预处理采集水样于适当大小的玻璃瓶中（根据水质情况而定），用玻璃塞塞紧，且不留气泡。采样后，需在2h内测定；否则，应在4或4以下保存，且应在采集后10h内测定。水样的pH若超出6.5-7.5范围时，可用0.5mol/L氢氧化钠溶液或0.5mol/L盐酸溶液调节pH值至近于7，但用量不要超过水样体积的0.5%。若水样的酸度或碱度很高，可改用高浓度的碱或酸进行调节中和。2、稀释水的制备在 5-20L 玻璃瓶内装入一定量的水，控制水温在 20左右。然后用无油空气压缩机或薄膜泵，将此水曝气 2-8h，使水中的溶解氧接近饱和，也可以鼓入适量纯氧。瓶口盖以

8、两层经洗涤晾干的纱布，置于 20培养箱内放置数小时，使水中的溶解氧量达到8mg/L。临用前向每升水中加入CaCl2溶液、FeCl3溶液、MgSO4溶液、磷酸盐缓冲溶液各1mL，并混合均匀。稀释水的pH 值应为7.2，其 BOD5应小于 0.2 mg/L。3、水样的稀释及分装根据确定的稀释倍数，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀释水于1000 mL量筒中，然后加入所需水样，再引入稀释水（或接种稀释水）至1000mL，用带胶板的玻璃棒小心上下搅匀。搅拌时勿使玻璃棒的胶板露出水面，防止产生气泡。将稀释好的水样沿瓶壁慢慢到到入两个预先编号、体积相同的碘量瓶中，直到充满后溢出少许为止，盖严并水封，注意瓶内不能有

9、气泡。另取两个有编号的相同的碘量瓶用同样的方法加入稀释水作为空白对照。4、培养将稀释的水样，稀释水空白各取一瓶放入20+1的培养箱内培养5d，培养过程中需每天添加封口水。5、溶解氧的测定 采用碘量法分别测定培养前后水样及稀释水空白的溶解氧的值。测定方法如下：（1）取下瓶塞，立即用移液管加入1mL MnSO4溶液。加注时，应将吸量管插入液面下约10mm，切勿将移液管中的空气注入瓶中。以同样的方法加入2mL碱性KI溶液，盖上瓶塞，注意瓶内不能留有气泡。然后将碘量瓶颠倒混合3次，静置。待生成的棕色沉淀物下降至瓶高一半时，再颠倒混合均匀。继续静置，待沉淀物下降至瓶底后，轻启瓶塞，立即用移液管插入液面以

10、下加入2mL（1+5）硫酸。小心盖好瓶塞颠倒摇匀，此时沉淀应溶解；若溶解不完全，可再加入少量（1+5）H2SO4溶液至溶液澄清且呈黄色或棕色（因析出游离碘）。置于暗处反应5min。（2）从碘量瓶内取出2份50.0mL水样，分别置于2个250mL锥形瓶中，用Na2S2O3溶液滴定至溶液呈淡黄色时，加入1%淀粉溶液1mL，继续滴定至蓝色刚好消失为止，即为终点，记录Na2S2O3用量。6、计算（1）溶解氧浓度的计算溶解氧浓度C1V181000/V2式中：C1Na2S2O3溶液的浓度(mol/L)； V1消耗的Na2S2O3溶液的体积(mL)； 8氧的摩尔质量(1/2O，g/mol)； V2水样的体积

11、(mL)。（2）BOD5的计算BOD5(mg/L)=(C2-C3)-(B1-B2)f1/f2式中：C2水样在培养前的溶解氧浓度(mg/L)； C3水样经5天培养后，剩余溶解氧浓度(mg/L)； B1稀释水培养前的溶解氧浓度(mg/L)； B2稀释水培养后的溶解氧浓度(mg/L)；f1 稀释水在培养液中所占比例；f2 水样在培养液中所占比例。五、注意事项1、本方法适用于测定BOD5大于或等于2mg/L，最大不超过6000 mg/L的水样。当水样BOD5大于6000 mg/L，会因稀释带来一定的误差。2、若样品中的有机物含量较多，BOD5的质量浓度大于6mg/L，样品需要适当稀释后测定；对不含或含

12、微生物少的工业废水，如酸性废水、碱性废水、高温废水、冷冻保存的废水或经过氯化处理等的废水，在测定BOD5时应进行接种，以引进能分解废水中有机物的微生物当废水中存在难以被一般生活污水中的微生物以正常的速度降解的有机物或含有剧毒物质时，应将驯化后的微生物引入水样中进行接种。3、接种液：可选用以下任一方法，以获得适用的接种液。 （1）城市污水，一般采用生活污水， 在在室温下放至一昼夜，取上层清液使用。 （2） 表层土壤浸出液，取 100g 花园土壤或植物生长土壤，加入 1L 水，混合并静置 10min ，取上清液供用。（3） 用含城市污水的河水或湖水。 （4） 污水处理厂的出水。 （5） 当分析含有

13、难于降解的废水时， 在排污口下游 3-8km 处取水样作为废水的驯化接种液。如无此种水源，可取中和或经适当稀释后的废水进行连续曝气、每天加入少量该种废水，同时加入适量表层土壤或生活污水，使能适应该种废水的微生物大量繁殖。当水中出现大量絮状物，或检查其化学需氧量的降低值出现突变时，表明适用的微生物已进行繁殖，可用作接种液。一般驯化过程需要 3-8 天。 4、接种稀释水：取适量接种液，加于稀释水中，混匀。每升稀释水中接种液加入量生活污水为 1-10mL；表层土壤浸出液为20-30mL；河水、湖水为 10-100mL。接种稀释水的 pH 值应为 7.2，其 BOD5值宜在 0.3-1.0 mg/L

14、之间为宜。接种稀释水配制后应立即使用。5、测定一般水样的 BOD5时，硝化作用很不明显或根本不发生。但对于生物处理池出水，则含有大量硝化细菌。因此，在测定 BOD5时也包括了部分含氮化合物的需氧量。对于这种水样，如只需测定有机物的需氧量，应加入硝化抑制剂，如丙烯基硫脲（ATU，C4H8N2S）等。6、确定稀释倍数，稀释比根据水中有机物的含量来确定。较为清洁的水样不用稀释；污染严重的水样，稀释1001000倍；常规沉淀过的污水，稀释20100倍；受污染的河水，稀释04倍、原则上以培养后减少的溶解氧占培养前的溶解氧的4070为宜。7、f1，f2的计算，如培养液的稀释比为3%，即3分水样，97分稀释

15、水，则f1=0.97，f2=0.03。8、为保证微生物生长的需要，稀释水中还应加入一定量的无机营养盐和缓冲物质。9、Na2S2O3溶液浓度的标定方法在250mL碘量瓶中加入25mL蒸馏水、0.5g碘化钾、10.00mL 0.0250mol/L重铬酸钾溶液和5mL（1+5）硫酸，摇匀，加塞后置于暗处5min，用待标定的硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色，然后加入1淀粉溶液1.0mL，继续滴定至蓝色刚好变为淡绿色为止，记录用量。平行做3份，取平均值。硫代硫酸钠的物质的量浓度C1为 C1=C210/V1式中： C2重铬酸钾标准溶液的浓度（mol/L）； V1消耗的硫代硫酸钠溶液的体积(mL)。 六、思考题1

16、、测定BOD的方法有哪些？七、参考文献1、程树培环境生物技术实验指南南京：南京大学出版社，1995 实验二 固定化酵母细胞对Cr6+的生物吸附一、实验目的1、掌握用海藻酸钠制备固定化酵母细胞的方法。2、掌握用国标（GB7467-87）测定溶液中Cr6+的原理和方法。二、实验原理将海藻酸钠溶液与细胞液混合，此混合液滴加到CaC12溶液中，CaC12中的钙离子与海藻酸根离子螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶，从而将细胞固定在凝胶颗粒中的微小空格中。在酸性溶液中，水样中呈现强氧化性的Cr6+ (以Cr2O72-计)将二苯碳酰二肼氧化为二苯缩二氨基脲，生成的二苯缩二氨基脲再与Cr6+还原产物Cr3+形成紫

17、红色络合物，OCNHNHC6H5NHNHC6H5二苯碳酰二肼+Cr6+OCNHNHC6H5N = NC6H5二苯缩二氨基脲+Cr3+紫色络合物在一定范围内，该紫红色络合物色度与Cr6+的含量成线性关系，其吸光度与浓度的关系符合朗伯-比尔定律，在540nm波长处有最大吸收，因此，可以用分光光度法测定溶液中Cr6+含量。三、实验器材与试剂1、样品含Cr6+溶液，活性干酵母。2、器材三角瓶，玻璃棒，试管，烧杯，容量瓶，量筒，电子天平，30恒温培养箱，注射器，恒温水浴锅，分光光度计，离心机。3、试剂H2SO4，H3PO4，K2Cr2O7，CaCl2，海藻酸钠，二苯碳酰二肼，丙酮。（1）（1+1）H2S

18、O4溶液：将H2SO4溶液缓缓加入同体积的蒸馏水中，混匀。（2）（1+1）H3PO4溶液：将H3PO4溶液与等体积的蒸馏水混合。（3）铬标准贮备液：称取于110干燥2h的K2Cr2O7 0.28290.0001g， 用水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。此溶液1mL含0.10mg Cr6+。（4）铬标准溶液：称取25.00mL铬标准贮备液置于500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。此溶液1mL含5.00g Cr6+。使用当天配制此溶液。（5）显色剂：称取二苯碳酰二肼 (C13H14N4O) 0.2g，溶于50mL丙酮中，加水稀释至100mL，摇匀，贮于棕色瓶，置冰箱中。

19、色变深后，不能使用。四、实验步骤（一）固定化酵母细胞的制备1、酵母细胞活化取1g活性干酵母，放入50mL的小烧杯中，加入蒸馏水15 mL，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，放置1h左右使其活化。2、CaCl2溶液的配制称取0.83g无水CaCl2，放人200mL的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。3、海藻酸钠溶液配制 称取0.8g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中，加人20mL蒸馏水，于恒温水浴锅中加热直至完全溶化，用蒸馏水定容至15mL，并冷却至室温。4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却后，加人已活化的醉母细胞液，进行充分搅拌，使两者混合均匀。5、酵母细胞

20、固定化将混合好的溶液转移至注射器中，以恒定的速度缓慢地将溶液滴加到CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右，过滤，称取凝胶珠的湿重W。（二）Cr6+的吸附将100mL，Cr6+浓度为50mg/L的重铬酸钾溶液加入到250mL的锥形瓶中，再加入固定有酵母细胞的凝胶珠，置于摇床（30，140r/min）上振荡0.5h，过滤，测定滤液中Cr6+的残余浓度，计算Cr6+的吸附率和吸附量。（三）Cr6+的测定1、标准曲线的制作 向一系列50mL比色管中分别加入0、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、1

21、0.00mL铬标准溶液，用水稀释至刻度线。分别加入0.5mL H2SO4溶液和0.5mL H3PO4溶液，摇匀。加入2mL显色剂，摇匀。放置10min后，以试剂空白做参比，在540nm波长处测定吸光度。以Cr6+含量为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。2、Cr6+的测定取1mL样品溶液加入50mL比色管中，加蒸馏水稀释至刻度，分别加入0.5mL硫酸溶液和 0.5mL磷酸溶液，摇匀，再加入2mL显色剂，摇匀。放置10min后，在540nm波长处，用10或30mm的比色皿，以试剂空白做参比（参照标准曲线），测定吸光度。 （四）计算根据测得的吸光度从标准曲线上查出相应的Cr6+含量，再按以

22、下公式计算细胞对 Cr6+的吸附率和吸附量：吸附率（%）=（CiCf）/Ci100%吸附量（mg/g）=(CiCf)V/W式中：CiCr6+的起始浓度（mg/mL）；CfCr6+的最终浓度（mg/ mL）；V 溶液体积（mL）；W 吸附剂湿重（g）。五、注意事项1、选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一。2、海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。3、海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解。4、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌。5、海藻酸钠胶体

23、在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右。6、如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。7、检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法：（1）用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。（2）在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。8、如样品液有颜色，则要进行色度校正后才能测定吸光度。六、思考题1、什么是活化？七、参考文献1、国家环境保护总局，

24、水和废水监测分析方法编委会编.水和废水监测分析方法(第四版) M.北京:中国环境科学出版社，2002实验三 高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定一、实验目的1、掌握微生物分离纯化的基本操作；2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法；3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法；4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。二、实验原理在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高效菌株进行处理。这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体

25、、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。本实验通过筛选苯酚降解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。 + COOHCH2CH2COOH CH3COOH CO2+H2O从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。三、实验器材与试剂1、样品实验土样采自校园污水处理厂。2、器材恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸、pH试纸。3、试剂葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（Na

26、2B4O7）、4-氨基安替比林、过硫酸铵（NH4）2S2O8）、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、琼脂。苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇匀。此溶液溶度为1000mg/L。测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。Na2B4O7饱和溶液：称取Na2B4O7 40g，溶于1L蒸馏水中，冷却后使用，此溶液的pH值为10.1。3% 4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中，并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。2% （NH4）2S2O8溶液：称取分析出（NH4）2S2O8 2g，溶于蒸馏水中，并稀释至100m

27、L，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。4、培养基富集培养基：蛋白胨0.5g，K2HPO4 0.1g，MgSO4 0.05g，水1000mL，调节pH 7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。基础培养基：K2HPO4 0.6g，KH2PO4 0.4g，NH4NO3 0.5g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.025g，水1000mL，调节pH 7.0-7.5，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。四、实验步骤（一）富集培养和驯化采集活性污泥或土样，接种于装有100mL富集培养基和玻璃珠并加有适量苯酚（50mg/L）的三角瓶中，30振荡培养。待菌生长后，用无菌移液管吸取1

28、mL转至另一个装有100mL富集培养基和玻璃珠并加有适量苯酚的三角瓶中，如此连续转接2-3次，每次所加的苯酚量适当增加，最后可得酚降解菌占绝对优势的混合培养物。（二）平板分离和纯化1、用无菌移液管吸取经富集培养的混合液10mL，注入90mL无菌水中，充分混匀，并继续稀释到适当浓度。2、取适当浓度的稀释菌液，加一滴于固体平板（由富集培养基加入2%的琼脂组成，倒平板时添加适量的苯酚，浓度达到200 mg/L。）中央，用无菌玻璃涂棒把滴加在平板上的菌液涂平，盖好皿盖，每个稀释度做2-3个重复。3、室温放置一段时间，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于30恒温箱中培养2-3d。4、挑选不同菌落形态，在含适

29、量苯酚的固体平板上划线纯化。平板倒置于30恒温箱中培养2-3d。（三）转接斜面将纯化后的单菌落转接至补加适量酚的试管斜面，30恒温箱中培养2-3d。（四）降解实验用接种环取斜面菌苔一环，接种于100mL基础培养基中，添加适量的苯酚，30震荡培养2-3d。（五）酚含量的测定1、标准曲线的绘制：取100mL容量瓶7只，分别加入100mg/L苯酚标准溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，于每只容量瓶中加入Na2B4O7饱和溶液10mL，3% 4-氨基安替比林溶液1mL，再加入Na2B4O7和溶液10mL，2%（NH4）2S2O8 1mL，然后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。放置10m

30、in后将溶液转至比色皿中，在560nm处测定吸光度，根据吸光度和苯酚的量绘制标准曲线。2、培养液中苯酚含量的测定：取经降解的培养液30 mL，离心，取上清液10 mL于100 mL容量瓶中，加入Na2B4O7饱和溶液10mL，3% 4-氨基安替比林溶液1 mL，再加入Na2B4O7饱和溶液10mL，2%（NH4）2S2O8 1mL，然后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。放置10min后将溶液转至比色皿中，在560nm处测定吸光度，从标准曲线上查得苯酚的量。（六）、计算C（苯酚，mg/L）=查得的苯酚毫克数/101000苯酚脱除率=（C1-C2）/C1100%式中：C1-降解前溶液中的苯酚浓度；C2-降

31、解后溶液中的苯酚浓度；五、注意事项1、各种培养基的配制应严格按配方的要求完成，尤其是苯酚的称量和pH；2、涂布平板的菌悬液只作适度稀释，菌浓度不必过低；3、涂布平板的菌悬液不要过多或过少，0.2mL为宜；4、平板上挑取菌落时，要挑取单菌落；5、单碳源实验的培养基和培养条件一定要严格把握。六、思考题1、如何从环境中分离高效苯酚降解菌株？七、参考文献1、张清敏. 环境生物学实验技术，化学工业出版社，20052、王兰. 环境微生物学实验方法与技术，化学工业出版社，20093、刘娜等. 环境生物技术实验，清华大学出版社，20124、孔志明等. 现代环境生物学实验技术与方法，2005氧化亚铁硫杆菌脱除煤

32、炭中的无机硫一、实验目的1、掌握氧化亚铁硫杆菌脱除煤炭中无机硫的原理和方法。2、掌握测定溶液中SO42-浓度的原理和方法。二、实验原理氧化亚铁硫杆菌(Thiobaciiius ferrooxidans, 简称T. f 菌)是一种专性好氧、嗜酸性的化能自养菌，广泛分布在温泉、 火山裂缝、 金属硫化矿和煤矿的酸性矿坑水中。以S和Fe2+作为能源物质进行生命活动，在有氧和酸性条件下将 Fe2+氧化为 Fe3+、S氧化为硫酸盐。改菌被广泛用于生物浸矿、酸性工业废水处理和煤炭脱硫等方面。T. f菌能吸附在煤炭中黄铁矿的表面，在生长过程中对黄铁矿进行氧化分解，将硫脱除，反应方程式为：2FeS2+7O2 2

33、FeSO4+2H2SO42FeSO4+ 1/2O2+ H2SO4 Fe2(SO4)3+H2OFeS2+ Fe2(SO4)3 3FeSO4+2S2S+ 3O2+2H2O 2H2SO4在酸性溶液中，BaCrO4与硫酸盐生成BaSO4沉淀和CrO42-，反应方程式为：SO42-+BaCrO4 =BaSO4 +CrO42-将溶液用氨水中和至弱碱性后，离心分离生成的BaSO4及过量的BaCrO4沉淀。溶液呈现的黄色是SO42-所定量置换出的CrO42-的颜色，在一定范围内，溶液的颜色与CrO42-的含量成线性关系，其吸光度与浓度的关系符合朗伯-比尔定律，在420nm波长处有最大吸收，因此可用分光光度法测

34、定SO42-的含量。三、实验器材与试剂1、样品煤炭2、菌种氧化亚铁硫杆菌，西南科技大学生命科学与工程学院生物工程实验室保存。3、器材电子天平，高速离心机，分光光度计，蒸汽灭菌锅，超净工作台，生化培养箱，恒温摇床。4、试剂K2CrO42H2O，BaCl2，K2SO4，HCl，(NH4)2SO4，KCl，MgSO47H2O，Ca(NO3)2，FeSO47H2O，氨水。种子培养基：A液：（NH4）2SO4 3g，KCl 0.1g，K2HPO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，Ca(NO3)2 0.01g，蒸馏水600mL，调节pH约为2，121温热灭菌30min；B液：FeSO47H2O 44.2g，蒸馏水 400mL，调节pH约为2，0.22m微孔滤膜过滤除菌，现配现用。使用前将A与B液混合，调节pH约为2。发酵培养基：（NH4）2SO4 3g，KCl 0.1g，K2HPO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，蒸馏水600mL，调节pH约为4，121温热灭菌30min。BaCrO4悬浮液：称取K2CrO42H2O 19.42g，BaCl2 24.43g，分别溶于1 L蒸馏水中，加热至沸腾。然后将两种溶液共同倒入3L烧杯内，此时生成黄色BaCrO4沉淀，待沉降后，倾去清液。用约1L蒸馏水洗涤沉淀，共需洗涤5次左右。最后加蒸馏水至1L，使成悬浮液，每次使用前