第2章 核酸化学

1、第二章 核 酸 核酸（nucleic acid）是生物特有的重要的大分 子化合物，广泛存在于各类生物细胞中,核酸上携带 有遗传信息。核酸的组成单位核苷酸（nucleotides） 还是生物体各种生物化学成分代谢转换过程中的能量 “货币”（如ATP），而具有传递激素及其他细胞外 刺激的化学信号能力的环化核苷酸（如cAMP），被誉 为生物体的第二信使，并且核苷酸还是一系列酶的辅 助因子和代谢中间体。因此，核酸及其组成单位在生 物的个体发育、生长、繁殖、遗传和变异等生命过程 中起着重要的作用。 第一节 核酸概述 1868 年，瑞土的一位年轻科学家FMiescher （18441895 年）从外科绷带

2、上脓细胞的细胞 核中分离出了一种有机物质，它的含磷量之高 超过任何当时已经发现的有机化合物，并且有 很强的酸性。由于这种物质是从细胞核分离出 来的，当时就称它为核素（nuclein）. 1889 年，才有人成功地分离得到不含蛋白质 的这种新物质，因为是从细胞核中分离出来 的酸性物质，所以叫核酸。 1944 年，由艾弗里（O. T.Avery）等人的著 名的肺炎球菌转化试验问世后，核酸是主要 遗传物质的地位才被确立。 1952 年，郝尔歇（A. D. Hershey）等 人用同位素标记法研究T2 噬菌体的感染 作用，既用同位素32P 标记噬菌体的DNA， 35S 标记蛋白质，然后感染大肠杆菌。

3、结果只有32P-DNA进入细菌细胞内，35S- 蛋白质仍留在细胞外，从而进一步肯定 了DNA 的遗传作用。 1950 年以后，Chargaff，Markham 等提出了 A-T、G-C 之间互补的概念。这一极其重要的 发现，为以后Watson-Crick 建立DNA 双螺旋 结构模型提供了重要依据。 1953 年DNA 双螺旋结构模型的提出，被认为 是本世纪在自然科学中的重大突破之一。分子 生物学所取得的突飞猛进的发展与DNA 双螺旋 结构模型的建立是分不开的。 70年代 建立DNA重组技术，改变了分子生物学的 面貌，并导致生物技术的兴起。 80年代 RNA研究出现第二次高潮：ribozyme

4、、反 义RNA、“RNA世界”假说等等。 90年代以后 实施人类基因组计划（HGP）, 开 辟了生命科学新纪元。生命科学进入后基因时代： 功能基因组学（functional genomics） 蛋白质组学（proteomics） 结构基因组学（structural genomics） RNA组学（Rnomics）或核糖核酸组学 （ribonomics） 核酸分类和分布 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）:遗传信息 的贮存和携带者，生物的主要遗传物质。在真核细胞中，DNA 主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中均有各自的DNA。原 核细胞没有明显的细胞核结构，DN

5、A存在于称为类核的结构区 。每个原核细胞只有一个染色体，每个染色体含一个双链环状 DNA。 核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）：主要参与遗传信 息的传递和表达过程，细胞内的RNA主要存在于细胞质中，少 量存在于细胞核中，病毒中RNA本身就是遗传信息的储存者。 另外在植物中还发现了一类比病毒还小得多的侵染性致病因子 称为类病毒，它是不含蛋白质的游离的RNA分子，还发现有些 RNA具生物催化作用（ribozyme）。 第二节 核酸的化学组成 一、碱 基 二、戊 糖 三、磷 酸 核酸是含磷的生物大分子，任何核酸都 含有磷酸，所以核酸呈酸性，可与Na+、多胺、 组蛋白结合。核酸中的

6、磷酸参与形成3,5- 磷酸二酯键，使核酸连成多核苷酸链。 四、核 苷 胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷 N N OH HO N N NH2 HO N N OH H2N N N N N N N NH2 O H H OH H OH H HOCH2 HOCH2 O H H OH H OH H O H H OH H OH H HOCH2 O H H OH H OH H HOCH2 五、核苷酸 N N N N NH H NH N H O O O OHOH OH OHCH2POH O O O 核苷酸核苷酸 碱基连接（核苷键）碱基连接（核苷键） 酯酯 键键 （对（对DNA为为H） 八种核苷酸八种核苷

7、酸 RNA的名称为单的名称为单/二二/三苷酸，三苷酸， DNA在单在单/二二/三前加脱氧两字。三前加脱氧两字。 如如AMP称腺苷一磷酸称腺苷一磷酸(或腺苷酸）或腺苷酸） dAMP称为脱氧腺苷一磷酸（脱氧腺苷酸）称为脱氧腺苷一磷酸（脱氧腺苷酸） 稀有核苷酸与上类似稀有核苷酸与上类似 腺腺嘌嘌呤呤 A 鸟鸟嘌嘌呤呤 G 胞胞嘧嘧啶啶 C 尿尿嘧嘧啶啶 U 胸胸腺腺嘧嘧啶啶 T RNA AMPGMPCMPUMP未未发发现现 DNAdAMPdGMPdCMP未未发发现现dTMP 六、细胞中的游离核苷酸及其衍生物 第三节 脱氧核糖核酸 一、DNA的碱基组成 对各种生物DNA 的主要四种碱基 （腺嘌呤、鸟嘌

8、呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶） 的组成进行了定量测定，发现来自不同 物种的DNA 有着不同的碱基比例，不同 碱基在数量上是紧密相关的，收集来自 许多物种DNA 碱基组成资料，导致 Chargaff 得出如下规律： 1所有DNA 中腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔含 量相等，即A=T；鸟嘌呤与胞嘧啶的摩 尔含量相等，即G=C。因此，嘌呤的总 含量与嘧啶的总含量相等，即 A+G=C+T。 2DNA 的碱基组成具有种的特异性，即不 同生物种的DNA 具有自己独特的碱基组 成比例（又称不对称率 ），可表示为 （A+T）/（G+C） 3. 同一种生物DNA 的碱基组成没有组织和 器官的特异性。生长发育阶段、营养状 态和环

9、境的改变都不影响DNA 的碱基组 成。 以上这些数量关系被称为Chargaff 定则，它们是建立DNA 三维结构和了解 DNA 如何编码遗传信息并把它们代代相 传的关键。 二、DNA的一级结构 核酸的一级结构是它的共价结构和 核苷酸顺序，在核酸中由部分或所有核 苷酸残基所形成的任何有规律的稳定结 构都可以看成是二级结构。 DNA 的一级结构是由数量极其庞大 的四种脱氧核糖核苷酸，即脱氧腺嘌呤 核苷酸、脱氧鸟嘌呤核苷酸、脱氧胞嘧 啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸，通过 3,5-磷酸二酯键连接起来的直线形或 环形多聚体。 3，5-磷酸二酯键磷酸二酯键 3 5 （1 1）核苷酸间以）核苷酸间以3-53-

10、5磷酸二酯键相连磷酸二酯键相连 （2 2）一端称为）一端称为5-5-磷酸端（磷酸端（5 5-P-P表示）表示） 一端称为一端称为3-3-羟基端（羟基端（3 3-OH-OH表示）表示） （3 3）多聚核苷酸链具有方向性，表示时，）多聚核苷酸链具有方向性，表示时， 需注明方向：需注明方向：5353或是或是3535 DNA一级结构的简写形式 戊糖 P 53 首端首端末端末端 P PPPP P pApCpTpG -pA-C-T-G 核苷酸顺序又称核苷酸顺序又称碱基顺序碱基顺序 三、DNA的空间结构 目前公认的DNA 双螺旋结构模型主要根据 Chargaff 定则及X-射线衍射图的结构，在1953 年

11、由Watson 和Crick两人提出的。Watson 和Crick 所用的资料来自在相对湿度为92%时所得到的DNA 钠盐纤维。这种DNA 称为B 型DNA（B-DNA）。在相 对湿度低于75%时获得的DNA 钠盐纤维，其结构有 所不同，称为A-DNA。此外还有Z-DNA 。在这里， 我们将比较详细的讨论B-DNA，因为生物体内天然 状态的DNA 几乎都以B-DNA 存在。 B-DNA的结构 具有以下特征： 1 两条反向平 行的多核苷酸链 围绕同一中心轴 相互缠绕。 2嘌呤碱基与嘧啶碱基位 于双螺旋的内侧，磷酸 与核糖在外侧，彼此通 过3,5-磷酸二酯键相 连接，形成DNA 分子的 骨架。碱基

12、平面与纵轴 垂直，糖环的平面则与 纵轴平行。多核苷酸链 的方向取决于核苷酸间 磷酸二酯键的走向。习 惯上以C5C3为正向。 两条链均为右手螺旋。 3双螺旋的平均 直径为2nm，两 个相邻的碱基对 之间相距的高度， 即碱基堆积距离 为0.34nm，两个 核苷酸之间的夹 角为36。因此， 沿中心轴每旋转 一周有10 个核 苷酸。每一圈的 高度（即螺距） 为3.4nm。 4两条核苷酸链依靠彼此 碱基之间形成的氢键相连 而结合在一起。A 只能与 T 相配对，形成两个氢键； G 与C 相配对，形成三个 氢键。 腺嘌呤腺嘌呤胸腺嘧啶胸腺嘧啶 鸟嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胞嘧啶 上述碱基之间配对的原则称为碱基 互补（

13、base complementary）。根据碱 基互补原则，当一条多核苷酸链的序列 被确定以后，即可推知另一条互补链的 序列。碱基互补原则具有极重要的生物 学意义。DNA 复制、转录、反转录等的 分子基础都是碱基互补配对。 碱基堆积力碱基堆积力形成疏水环境（主要因素）形成疏水环境（主要因素） 。 碱基配对的碱基配对的氢键氢键。GCGC含量越多，越稳定。含量越多，越稳定。 磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正 离子之间形成离子之间形成离子键离子键，中和了磷酸基上的负电荷，中和了磷酸基上的负电荷 间的斥力，有助于间的斥力，有助于DNADNA稳定。

14、稳定。 碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性 活性小分子的攻击。活性小分子的攻击。 稳定双螺旋结构的因素稳定双螺旋结构的因素 四、DNA的三级结构 DNA 的三级结构包括线状DNA 形成的纽结、 超螺旋和多重螺旋以及环状DNA 形成的结、超 螺旋和连环等多种类型，其中超螺旋是最常见 的，所以，DNA的三级结构主要是指双螺旋进 一步扭曲形成的超螺旋。这种折叠应该是高度 有序的，因为它们不仅要适合它们所处的细小 空间，而且这种折叠和包装还得允许DNA 能被 接近以进行复制和转录。 第四节 核糖核酸 一、RNA的结构 组成RNA 的核 苷酸也是以3

15、,5- 磷酸二酯键彼此连 接起来的。但RNA 分子比DNA 分子小 得多（含几十至几 千个核苷酸），是 单链线形分子。天 然RNA 只有局部区 域为双螺旋结构。 RNA 单链分子 通过自身回折使得 互补的碱基对相遇， 通过氢键结合形成 反平行右手双螺旋 结构（称为茎）， 不能配对的区域形 成突环（称为环）， 被排斥在双螺旋结 构之外。RNA 的这 种结构称为茎环结 构，是各种RNA 的 共同的二级结构特 征。 （一）tRNA 1. tRNA 的一级结构 tRNA 的一级结构指tRNA 分子中核 苷酸的排列顺序。 tRNA 的一级结构有以下特征： 分子量在25kd 左右，由7493 个核 苷酸组

16、成，大多数为76 个核苷酸组成的 单链，沉降系数在4S 左右； 碱基组成中有较多 的稀有碱基. 3末端都为- PCPCPAOH，用来接受 活化的氨基酸。所以 这个末端称接受末端。 5-末端大多为PG-， 也有PC-的。 有十几个位置上的 核苷酸在几乎所有的 tRNA 中都是不变的， 即为恒定核苷酸. 2. tRNA 的二级结构 tRNA 的二级结构 都呈三叶草形. 基本特征是：在3 末端有一段以CCA 为主的单链区，由7对 碱基组成，称氨基酸 茎。由于双螺旋结 构所占比例甚高（大 约有50%的核苷酸配 对），分别形成了4 个双螺旋区，称为茎 （或称为臂）。这4 个茎是：氨基酸接受 茎、二氢尿嘧

17、啶茎 （简称D 茎）、反密 码子茎和TC 茎。 tRNA的三叶草型二级结构的三叶草型二级结构 1 1 2 2 3 3 反密码子环反密码子环 反密码子反密码子 D环环 TC环环 额外环额外环 四四 环环 四四 臂臂 大约有50%的核 苷酸不配对，分别 形成了4 个环：二 氢尿嘧啶环（简称 D 环）、反密码子 环、TC 环和额 外环（又称可变 环）。不同的 tRNA 分子在长度 上的变化主要发生 在三个区域，即D 环、额外环的核苷 酸数目及D 茎上配 对的核苷酸数目不 同。 3tRNA 的三级结构 tRNA 三级结构的形状象一个倒写的 L 字母,倒L 型结构是tRNA三级结构的共 同特征。 （二）

18、mRNA mRNA 是以DNA 为模板合成的。mRNA 又是蛋白质合成的模板，每一种多肽都 有一种特定的mRNA负责编码，所以细胞 内mRNA 的种类是很多的，分子大小不一。 mRNA 的二级结构也是通过单链自身折叠 而形成的茎环结构. 原核生物和真核生物的mRNA 的结构有所不 同，其特点区别如下： 1. 原核生物的mRNA 是多顺反子，真核生 物的mRNA 是单顺反子。 2. 极大多数真核细胞mRNA 在3-末端有一 段长约200 个核苷酸的polyA。 3. 真核细胞mRNA 5-末端还有一个特殊的 结构5-m7G-5ppp5-Nm-3-P，称为5- 帽子（cap）。 5帽子 密码子 3

19、polyA m7Gppp- AUG GUG UAA AAAAAA 5端非翻译区 编码区 3非翻译区 真核生物真核生物mRNA的共价结构的共价结构 帽子结构帽子结构 为5-帽子结构的功能是：封闭 mRNA 的5端，使其没有游离的5-磷酸， 这种结构有抗5-核酸外切酶降解的作用， 使mRNA 更稳定；作为mRNA 与核糖体结 合的信号，无帽子结构的mRNA 不能与核 糖体的40S 亚基结合；可能与蛋白质合 成的正确起始作用有关。 （三）rRNA rRNA 是核 糖体的组成成 分，约占核糖 体重量的三分 之二左右。 rRNA 的种类、 大小一般用沉 降系数（S）表 示。rRNA 是由 大约1205

20、000 个核苷酸组成 的单链. 第六节 核酸的理化性质与研究方法 一、一般物理性质 1. 溶解度 DNA 为白色纤维状固体，RNA 为白 色粉末状固体，它们都微溶于水，其钠 盐在水中的溶解度较大。 2. 分子大小 DNA 分子极大，分子量在106 以上， RNA 的分子比DNA 分子小得多。核酸分 子的大小可用长度、核苷酸对（或碱基 对）数目、沉降系数（S）和分子量等来 表示。 3. 形状及粘度 核酸（特别是线形DNA）分子极为细 长，其直径与长度之比可达1：107，因此 核酸溶液的粘度很大，即使是很稀的DNA 溶液也有很大的粘度。RNA 溶液的粘度 要小得多。核酸若发生变性或降解，其 溶液的

21、粘度降低。 二、核酸的紫外吸收 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、 核苷、核苷酸和核酸在240290nm 的紫外波 段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸 收特性。从A260/A280 的比值即可判断样品 的纯度。纯DNA 的A260/A280 应为1.8，纯 RNA 应为2.0。 三、核酸的沉降特性 可以用超离心法 纯化核酸，或将不同 构象的核酸进行分离， 也可以测定核酸的沉 降常数与分子量。RNA 分离常用蔗糖梯度。 分离DNA 时用得最多 的是氯化铯梯度。 四、核酸的两性解离及凝胶电泳 核酸既含有呈酸性的磷酸基团，又 含有呈弱碱性的碱基，故为两性电解质， 可发生两性解离。核酸是具有较强

22、的酸 性的两性电解质，其解离状态随溶液的 pH 而改变。当核酸分子的酸性解离和碱 性解离程度相等，所带的正电荷与负电 荷相等，即成为两性离子，此时核酸溶 液的pH 就称为等电点(pI）。 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱 性的缓冲液使核酸解离成阴离子，置于电 场中便向阳极移动，这就是电泳。凝胶电 泳是当前核酸研究中最常用的方法。它有 许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙 烯酰胺凝胶电泳。 五、核酸的变性、复性 （一）变性 变性作用是核酸的重要物化性质。核酸的 变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链的 无规则线团，使核酸的某些光学性质和流体力 学性质发生改变

23、，有时部分或全部生物活性丧 失，并不涉及共价键的断裂。多核苷酸骨架上 共价键（3, 5-磷酸二酯键）DNA 的变性与 复性的断裂称核酸的降解。 DNA 变性后，由于双螺旋解体，碱基 堆积已不存在，藏于螺旋内部的碱基暴露 出来，这样就使得变性后的DNA 对260nm 紫外光的吸光率比变性前明显升高（增 加），这种现象称为增色效应 （hyperchromic effect）。常用增色效应 跟踪DNA 的变性过程，了解DNA的变性程度。 可以引起核酸变性的因素很多，如加 热、极端的pH、有机溶剂、酰胺、尿素 等。由温度升高而引起的变性称热变性。 由酸碱度改变引起的变性称酸碱变性。 DNA 热变性时，

24、其 紫外吸收值到达总增加 值一半时的温度，称为 DNA 的变性温度。由于 DNA 变性过程犹如金属 在熔点的熔解，所以DNA 的变性温度亦称为该DNA 的熔点或熔解温度 （melting temperature），用Tm 表示。DNA 的Tm 值一般 在7085之间，常在 0.15mol/L NaCI， 0.015mol/L 柠檬酸三钠 溶液中进行测定。 DNA 的Tm 值大小与下列因素有关： 1DNA 的均一性 2. G+C含量 3介质中的离子强度 （二）复性 变性DNA 在适当条件下，两条彼此 分开的链重新缔合成为双螺旋结构的过 程称为复性（renaturation）。DNA 复 性后，许

25、多物化性质又得到恢复，生物 活性也可以得到部分恢复。 淬火 退火 在一定条件下， 复性反应的速度 可以用C0t 来衡 量。C0为变性DNA 的原始浓度，以 核苷酸的摩尔浓 度表示，t 为时 间，以秒表示。 实验证明，两种 浓度相同但来源 不同的DNA，复性 时间的长短与基 因组的大小有关。 具有很多重复序 列的DNA，复性也 快。 DNA 复性后，其溶液的A260 值减小， 最多可减小至变性前的A260 值，这现象 称减色效应（hypochromic effect）。 引起减色效应的原因是碱基状态的改变， DNA 复性后其碱基又藏于双螺旋内部， 碱基对又呈堆积状态，它们之间介电子 的相互作用又

26、得以恢复，这样就使碱基 吸收紫外光的能力减弱。可用减色效应 的大小来跟踪DNA 的复性过程，衡量复 性的程度。 (三)核酸的杂交(hybridization) 根据变性和复性的原理，将不同来 源的DNA 变性，若这些异源DNA 之间在 某些区域有相同的序列，则退火条件下 能形成DNA-DNA 异源双链，或将变性的 单链DNA 与RNA经复性处理形成DNA-RNA 杂合双链，这种过程称为分子杂交 （molecular hybridization）. (四) PCR 技术 聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction），即PCR 技术，是一 种在体外快速扩增特定基因或DNA

27、 序列 的方法，故又称为基因的体外扩增法。 PCR 技术的原理与细胞内发生的DNA 复制过程十分类似。首先是双链DNA 分子 在高温下加热时分离成两条单链DNA 分子， 然后DNA 聚合酶以单链DNA 为模板并利用 反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸 （dNTPs）合成新生的DNA 互补链。 当PCR 反应体系中存在分 别与两条链互补的一对引物 时，两条单链DNA 都可作为 模板合成新生互补链。并且 每一条新生链的合成都是从 引物的退火结合位点开始， 并沿着相反链延伸，这样在 每一条新合成的DNA 链上都 具有新的引物结合位点。然 后反应混合物经再次加热使 新、旧两条链分开，并加入 下轮的反应循环。经n 次循 环之后，反应DNA 固相合成 混合物中所含有的双链DNA 分子数，即两条引物结合位 点之间的DNA 区段的拷贝数， 理论上的最高值应是2n。可 见， PCR 反应涉及多次重复 进行的温度循环周期，而每