植物激素的测定方法

1、植物激素的酶连免疫分析法植物激素的酶连免疫分析法dnm-9602gdnm-9602g酶标分析仪酶标分析仪dnm-9602 dnm-9602 标配酶标分析仪标配酶标分析仪 dnm-9602adnm-9602a酶标分析仪酶标分析仪几种酶标分析仪几种酶标分析仪操操 作作 步步 骤骤包被包被-温育温育-洗涤洗涤-竞争竞争-温育温育-洗涤洗涤-加二抗加二抗-温育温育- -洗涤洗涤-显色显色-比色比色-计算计算包包 被被 每小孔中加入每小孔中加入100l包被缓冲液，然后包被缓冲液，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内。盘内。 37 下下1.5小时。小时。洗洗 板板将反应液甩

2、干并在报纸上拍净。第一将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第加第2次。共洗涤次。共洗涤3次。次。竞竞 争争即加标准物、待测样和抗体。即加标准物、待测样和抗体。加标样及待测样：加标样及待测样： 取适量所给标样稀释配成：取适量所给标样稀释配成： abaaba标准曲线的最大浓度为标准曲线的最大浓度为100ng/ml,100ng/ml,然后再依次然后再依次2 2倍稀倍稀释释8 8个浓度（包括个浓度（包括2 2个个0ng/ml0ng/ml，加入前两行的最后两，加入前两行的最后两排排 ）。将系列标准样加入）。将系列标准样加入9696孔酶

3、标板的孔酶标板的1 1、2 2、3 3行，行，每个浓度加每个浓度加3 3孔，每孔孔，每孔50l,50l,其余孔加待测样，每个其余孔加待测样，每个样品重复样品重复3 3孔，每孔孔，每孔50l50l。加加 抗抗 体体在微孔中加入一定量的抗体在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加混匀后每孔加50l，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。竞争条件竞争条件37左右左右0.5h。洗洗 板板将反应液甩干并在报纸上拍净。第一将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第加第2次。共洗涤次。共洗涤3次。次。加加“二抗二抗”

4、将适当的酶标二抗，加入将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释样品稀释液中（比如稀释倍数液中（比如稀释倍数1:1000就加就加10l），混），混匀后，在酶标板每孔加匀后，在酶标板每孔加100l，然后将其放入，然后将其放入湿盒内，置湿盒内，置37下，温育下，温育0.5h。洗洗 板板将反应液甩干并在报纸上拍净。第一将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第加第2次。共洗涤次。共洗涤3次。次。加底物显色加底物显色在每孔中加在每孔中加100l 邻苯二胺（邻苯二胺（opd）溶液）溶液（小心勿用手接触（小心勿用手接触opd），（每），（每10

5、ml溶液中溶液中含含4l 30% h202。混匀，然后放入湿盒内，。混匀，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加孔颜色还较浅），每孔加入入50l 2mol/l硫酸终止反应。硫酸终止反应。比比 色色 在酶联免疫分光光度计上依次在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品测定标准物各浓度和各样品490nm处的处的od值。值。 用酶标仪进行比色，以用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，标准孔为空白孔，在波长在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔处分别读取各标准孔和样本孔o

6、d值，值，以以od值为横坐标，值为横坐标，“标样标样激素激素含量的含量的对数对数”为纵坐为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的od值在标准曲线上查出待测样品的值在标准曲线上查出待测样品的aba含量的对数。含量的对数。利用利用反对数反对数求得求得aba的绝对含量。的绝对含量。数数 据据 分分 析析植物激素的测定方法？植物激素的测定方法？生物活性法生物活性法气相色谱（气气相色谱（气-质联机）质联机）液相色谱（液液相色谱（液-质联机）质联机）酶连免疫法（酶连免疫法（ elisa 法）法）问题：我们该选择哪种板呢？elisaelisa技术的特点与

7、局限性技术的特点与局限性 （1）elisa特点：在固相表面组装免疫活性物质形成免疫吸附剂；酶标记免疫活性物质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程；灵敏度特异性相对较高。（2）elisa局限性：只能检测到ng水平，精密度差（批内cv15-20%）；线性范围窄（一个数量级）。注意事项注意事项 ：（1）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分混匀反应。（2）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤不完全。（3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。（4）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴，否则出现较大误差。 酶联免疫吸附试验

8、酶联免疫吸附试验（以间接性（以间接性elisaelisa为例）为例）：抗抗 原原医学上重要的抗原医学上重要的抗原抗原的概述完全抗原 (complete antigen)半抗原(hapten)载体(carrier) btbbbt抗体（抗体（abab） 抗体（抗体（antibody,abantibody,ab) )是是b b细胞识别抗原后增细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。地结合，具有免疫功能。 免疫球蛋白（免疫球蛋白（immunoglobul

9、inimmunoglobulin，igig）是指具）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白一、基本概念：一、基本概念： 四肽链结构四肽链结构 ，链间二硫键连接，链间二硫键连接 两条重链（两条重链（h h）和两条轻链（）和两条轻链（l l） 氨基端和羧基端氨基端和羧基端。 根据氨基酸排列顺序的不同分为：根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（可变区（v v）和恒定区（）和恒定区（c c） 可变区（可变区（v v区）：区）：氨基酸组成、排列顺序变化较氨基酸组成、排列顺序变化较大大 恒定区（恒定区（c c区）：氨基酸数量、种类、排列顺序区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及及 含糖量都比较稳定含糖量都比较稳定可变区与恒定区可变区与恒定区 单克隆和多克隆抗体的比较和用途特异性敏感性均一性mcabpcab低差无高强有1、用于免疫学检测，辅助临床诊断2、mcab用于亲和层析，分离微量可溶性抗原3、标记的mcab用于基础研究，了解细胞分化等4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。 多克隆抗体多克隆抗体：多个抗原决定基：多个抗原决定基机体机体多种抗体的混合物多种抗体的混合物 单克隆抗