多克隆抗体的制备方法

1、多克隆抗体的制备及效价测定多克隆抗体的制备步骤一、器材剪刀（剪兔毛用）一把、弯头眼科手术镊子（游离血管用）一把、直头 眼科手术剪（剪血管用）一把，手术刀架，手术刀片，注射器（1ml、10ml， 25ml）附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶（200ml）或平皿（直径18cm）、 弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布 等。二、试剂生理盐水（或PBS）弗氏完全佐剂（Freund s complete adjuvant, FCA）弗氏不完全佐剂（Fre und s in complete adjuva nt， FIA）二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3三、免疫原：蛋白或KLH

2、偶联的多肽。每次免疫100-200 g免疫 原。四、兔子的选择兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健五、免疫用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下 进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。 这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。注：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性 对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳 动脉取血。取血量约5ml足矣。免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA 充分乳化后才能注射。将抗原液与

3、佐剂等比例混合后，置于混合器上 使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化 不充分，会影响免疫的效果，振荡后，lOOOrpm离心一分钟，如水相 和油相不分层即可注射。首次免疫用 FCA以后都用FIA。免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选 4-6点皮 下注射，每点注，间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择 临近位点，否则溃疡愈合不好）。每次免疫的抗原量约100卩g。免疫 次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。六、取血:免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫 产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫 后，可以获得较高效价

4、的抗体，每次取血量可以在 40ml，不要取太 多，否则会造成兔子贫血。前几次取血用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出 血清。最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：1、家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低 以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。2、沿颈部中线用手术刀切开皮肤约 10cm，分离皮下结缔组织， 直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌（小心操作，如碰到小血管出血， 可用止血钳止血）。3、用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织， 暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织。4、于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远 心端的丝线。近

5、心端的动脉用血管夹夹住。5、用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动 脉璧上剪一小口（勿剪断），插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎 固定于放血管上，以防放血管滑脱。6、松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血 100-120ml。七、血清的分离如果用三角瓶或平皿盛血，将器皿倾斜放置于37oC烘箱2hr,转 移到4oC沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集， 37oC烘箱放置2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上离心，10000RCF 10分钟。在血清中加入NaN3至终浓度，分装后-20oC保存。 效价测定一、实验器材仪器设备：手术剪、镊子、各个容量的量筒、

6、各个容量的烧杯、各个容量的称量瓶、各个容量的锥形瓶、玻片、温度计、称量天枰、移液枪、酶标仪、离心机二、实验试剂无水乙醇、二甲苯、PBS磷酸-柠檬酸缓冲液、0.01M枸橼酸盐缓冲液、0.05M碳酸盐缓冲液、多聚赖氨酸、花峡口蛙皮肤胰蛋白抗体、牛血清、苏木素、DAB显色液试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体、溶液、封闭液（5%脱脂奶粉）、30%H2O2溶液、OPD显色液、TMB显色液等三、实验方法1、包被抗原先配制缓冲液（），然后用新鲜配制缓冲液稀释抗原为 1：100 倍浓度溶液，取出 96 孔酶标板，用移液枪将稀释好的抗原加 到2X 10孔中，每孔100ul，标记未加抗原包被的孔，置于4C过夜

7、。2、洗涤从4C里取出已包被的酶标板， 甩干包被液，每孔中加入100ul 含Tween-20的PBS洗涤在35次，每次35min，最后一次洗 涤后在吸水纸上拍干。3、封闭用移液枪向每孔中加入 100ul 含 5%正常牛血清的 PBS-T (%Tween-20-PBS,置于37C恒温培养箱中温育1h,封闭非特异性结合位点。4、洗涤取出 已封闭的 酶标板， 甩干封闭液， 每孔中加入 100ul 含%Tween-20的PBS洗涤在35次，每次35min，最后一次洗 涤后在吸水纸上拍干。5、加样将在事先准备好的兔抗血清用PBS-T从 1: 10进行10倍梯度稀释到 1： 00，然后在加过包被液包被过的

8、两排孔的第 1 对孔中 加入免疫前兔血清为阴性对照，余下的 9 对孔分别按兔抗血清浓 度梯度依次加入样品，每孔100ul，置于37C恒温培养箱中温育 1h6、洗涤取出 加过 样的 酶标板 ，甩 干样 品血清 ， 每孔中 加入 100ul 含Tween-20的PBS洗涤在35次，每次35min，最后一次洗 涤后在吸水纸上拍干。7、加酶标二抗用PBS-T稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体至1: 10000倍，每孔加入100ul，置于37 C恒温培养箱中温育 1h。8、洗涤 取出加过酶标二抗的酶标板，甩干里面的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，在每孔中加入100ul含%Tween-20的PBS洗涤在 3 5 次，每次 3 5min ，最后一次洗涤后在吸水纸上拍干。9、加底物显色液配制含 %H2O2 的溶于磷酸 -柠檬酸缓冲液和 3ml0.1M 柠檬酸 混合）的mIOPD显色液，每孔加