蔗糖酶蛋白含量的测定Folin酚法

1、实验三实验三 蔗糖酶蛋白含量的测定蔗糖酶蛋白含量的测定 folinfolin- -酚法酚法一、实验目的和要求一、实验目的和要求1 1、学习、学习folinfolin- -酚法测定蛋白质含量的原理和方法；酚法测定蛋白质含量的原理和方法；2 2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量；、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量；3 3、掌握分光光度计的使用方法。、掌握分光光度计的使用方法。二、实验基本原理二、实验基本原理 folinfolin- -酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，folinfolin- -酚试剂是

2、酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜铜- -蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸- -磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其

3、色泽深浅与磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用蛋白质含量成正比。可用500nm500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.050.050.5g/l.0.5g/l.优点：优点： 简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。缺点：缺点： 该反应受多种因素的干扰。该反应受多种因素的干扰。1.1. 蛋白质蛋白质( (肽键肽键) ) oh oh 甲试剂甲试剂 ( (酒石酸钾钠铜盐酒石酸钾钠铜盐) ) 生成紫红色络合物生成紫红色络合物2.2. 蛋白质中的蛋白质中的酪氨酸酪氨酸和和色氨酸色氨酸 紫红

4、色络合物紫红色络合物 oh oh 乙试剂乙试剂 产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）二、实验材料与试剂二、实验材料与试剂1 1、实验材料：、实验材料： 蔗糖酶提取的各步分离纯化样品蔗糖酶提取的各步分离纯化样品、。可根据样品溶液的蛋。可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释。白质含量高低作适当的稀释。2 2、实验试剂：、实验试剂： 标准蛋白质溶液：标准蛋白质溶液：0.5g/l0.5g/l牛血清白蛋白牛血清白蛋白 folinfolin- -酚试剂酚试剂 甲试剂甲试剂 乙试剂乙试剂三、实验器材与仪器三、实验器材与仪器1 1、试管及试管架；、试管及试管架；2 2、可见光分

5、光光度计及、可见光分光光度计及1cm1cm玻璃比色皿；玻璃比色皿；3 3、恒温水浴箱、恒温水浴箱(25(25）。）。四、实验操作方法和步骤四、实验操作方法和步骤1 1、制备、制备folinfolin- -酚法蛋白质标准曲线酚法蛋白质标准曲线 取取6 6支试管，编号支试管，编号1 16 6，按表，按表1 1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于于500nm500nm处测定光吸收值（处测定光吸收值（ a a500nm500nm值）。值）。试管号试管号1 12 23 34 45 56 60.5g/l0.5g/l标准蛋白质溶液（标准蛋白质溶液（mlml）0 00.2

6、0.20.40.40.60.60.80.81 1蒸馏水蒸馏水 （mlml）1 10.80.80.60.60.40.40.20.20 0folinfolin- -酚试剂甲酚试剂甲 （mlml）5 55 55 55 55 55 5混匀，在室温混匀，在室温(25(25）下静置下静置10 min10 minfolinfolin- -酚试剂乙酚试剂乙 （mlml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5混匀，在室温下静置混匀，在室温下静置20min20mina a500nm500nm表表1 12 2、各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定、各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定 由于蔗糖酶提

7、取、分离纯化的各个样品的由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蔗糖酶蛋白质含量较高，因此蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品在测蔗糖酶提取分离纯化样品、 的的蔗糖酶蛋白质含量蔗糖酶蛋白质含量以前，以前，可根据各样品溶液的可根据各样品溶液的蔗糖酶蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖蔗糖酶酶蛋白质含量蛋白质含量a a500nm500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。 取取1313支试管，编号支试管，编号1 11313，按表，按表2 2依次加入各种试剂，并在分光光度计于依次加入各种试剂，并在分光

8、光度计于500nm500nm处测定光吸收值（处测定光吸收值（ a a500nm500nm值）。值）。样样 品品空空白白i(1:20 i(1:20 稀释稀释) )(1:15 (1:15 稀释稀释) )(1:10 (1:10 稀释稀释) )(原液原液) )编编 号号1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010111112121313样品样品液液v(mlv(ml) )0.00.00.050.050.20.20.50.50.050.050.20.20.50.50.050.050.20.20.50.50.050.050.20.20.50.5水水(ml)(ml)1.01.00.950.9

9、50.80.80.50.50.950.950.80.80.50.50.950.950.80.80.50.50.950.950.80.80.50.5folifolin n酚甲酚甲试剂试剂(ml)(ml)5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0混匀后，室温（混匀后，室温（25 25 ）放置放置1010分钟分钟folifolin n酚乙酚乙试剂试剂(ml)(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.

10、50.50.50.50.50.5混匀后，室温（混匀后，室温（2525 ）放置放置2020分钟分钟a a500nm500nm0 0表表2 23 3、绘制标准曲线并计算、绘制标准曲线并计算 绘制标准曲线：绘制标准曲线： 以光吸收值（以光吸收值（ a a500nm500nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/lmg/l）为横坐标，）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。 计算：计算： 蔗糖酶提取分离纯化的样品蔗糖酶提取分离纯化的样品、 稀释溶液的光吸收值稀释溶液的光吸收值（ a a500nm500nm），查蛋白质标准曲线得），查蛋白质标准曲线得蔗糖酶蔗糖酶蛋白含量，再进行样品蛋白含量，再进行样品、 溶液的最终溶液的最