生化基础法医学

1、遗传标记的分类遗传标记的分类1. 蛋白质类蛋白质类： 糖蛋白糖蛋白RBCRBC表面抗原表面抗原 WBCHLAWBCHLA 血清蛋白型血清蛋白型 同工酶型同工酶型 结构蛋白外貌特征结构蛋白外貌特征2. 核酸类核酸类： DNA RNA(mRNA, miRNA)多态性遗传标记多态性遗传标记 遗传多态性的定义：遗传特征在个体间存在的差异。遗传多态性的定义：遗传特征在个体间存在的差异。 按基因座为单位，低频等位基因的频率按基因座为单位，低频等位基因的频率 0.01 0.01。 遗传多态性的分类和各自的特点；遗传多态性的分类和各自的特点； 不同遗传多态性的检测方法；不同遗传多态性的检测方法； 表型举例表型

2、举例肤色（黑色）显性肤色（黑色）显性耳垂（有）显性耳垂（有）显性斜视（中国人）显性斜视（中国人）显性直发（东方人）显性直发（东方人）显性趾蹼显性趾蹼显性眼睑下垂显性眼睑下垂显性多指显性多指显性湿耳垢显性湿耳垢显性检验个体遗传特征的相关技术检验个体遗传特征的相关技术1. PCR1. PCR2. 2. 杂交杂交(hybridization(hybridization）3. 3. 酶切酶切(restriction endonuclease digestion)(restriction endonuclease digestion)4. 4. 测序测序(sequencing)(sequencing)5

3、. 5. 标记标记(labeled)(labeled)6. 6. 电泳电泳(electrophoresis)(electrophoresis)7. 7. 染色染色(staining)(staining)或显色或显色(display)(display)8. 8. 基因重组基因重组(DNA recombination)(DNA recombination)9. 9. 计算机搜索比对计算机搜索比对生化与分子生物学基础生化与分子生物学基础 1生物界中心法则生物界中心法则: DNARNAProtein 2蛋白质的特性蛋白质的特性 酶、同工酶、酶促反应（酶与底物的特异性关系）酶、同工酶、酶促反应（酶与底物

4、的特异性关系） 3核酸核酸(DNA, RNA)的基本特性：的基本特性： 碱基配对，可以碱基配对，可以 变性变性复性复性 Tm（变性一半的温度）= 4(G+C)+2(A+T) （melting temperature） (20bp 左右的核酸片段的左右的核酸片段的Tm值计算公式值计算公式) 溶液离子强度，变性剂，单链吸附现象。溶液离子强度，变性剂，单链吸附现象。4核酸核酸5端可以被标记端可以被标记：标记物标记物(放射性、非放射性放射性、非放射性)，标，标记要点，显示方法的差异。记要点，显示方法的差异。 5限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（识别特异性序列）（识别特异性序列）、特点、特点、意义。意义

5、。 6遗传变异遗传变异的分子基础：突变、重组、转座子、的分子基础：突变、重组、转座子、(精子或卵子精子或卵子 成熟成熟 过程过程)的交换重组的交换重组7 7基因工程技术基因工程技术： 杂交杂交（要（要探针），探针）， 测序技术（要引物）测序技术（要引物）， 重组（重组（加上调控序列，加上调控序列，promoter,promoter,可构成新可构成新的遗传物质的遗传物质），）， 8 8DNADNAchipchip：DNADNA分子的固定技术分子的固定技术9 9基因工程技术引起的基因工程技术引起的伦理学问题伦理学问题。 DNARNA转录、剪接、重排转录、剪接、重排 蛋白质蛋白质翻译翻译调控调控反转

6、录反转录逆转录病毒反义治疗 抗生素化疗放疗化疗化疗放疗放疗核酶microRNA复制复制蛋白质构像的改变蛋白质构像的改变-疯牛病（月元）疯牛病（月元）中心法则中心法则蛋白质的特性蛋白质的特性1.1. （毛发、精子、指甲等含胱氨酸量高，胱氨酸（毛发、精子、指甲等含胱氨酸量高，胱氨酸（- -S-S-S-S-）由由两个半胱氨酸脱氢（氧化）后形成两个半胱氨酸脱氢（氧化）后形成, , 加入加入b-b-巯基乙醇巯基乙醇还原还原后变成半胱氨酸（后变成半胱氨酸（SHSH），才易受蛋白酶分解。），才易受蛋白酶分解。2. 2. 蛋白质具有两性性质，蛋白质具有两性性质，等电点（等电点（pIpI）偏酸的溶液中带正电，偏

7、酸的溶液中带正电，反之带负电；可以电泳分离；反之带负电；可以电泳分离；3. 3. 加热、加入乙醇、强酸强碱、重金属离子或生物碱等试剂加热、加入乙醇、强酸强碱、重金属离子或生物碱等试剂可以使其可以使其变性变性；（酶的活性丧失）；（酶的活性丧失）4. 4. 有有4 4级结构，级结构，可可以成以成为抗原，为抗原，刺激产生抗体；刺激产生抗体；5. 5. 酶（包括限制性核酸内切酶）属蛋白质酶（包括限制性核酸内切酶）属蛋白质，其催，其催化功能依赖完整的酶蛋白功能域（化功能依赖完整的酶蛋白功能域（domaindomain），）， 底物有高度专一性底物有高度专一性，要求最适温度和最适，要求最适温度和最适pHp

8、H，有有激活剂和抑制剂。激活剂和抑制剂。 大多数酶在大多数酶在4040以上会失活。（以上会失活。（保存条件严格：保存条件严格：44以下，反复冻融使活性丧失以下，反复冻融使活性丧失）；）；Taq DNA Taq DNA 聚聚合酶例外。合酶例外。碱基配对碱基配对限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）1.单链多肽，最适单链多肽，最适pH为为68，NaCl有抑制作用，被有抑制作用，被MgMg2+ 2+ 激激活活，巯基有保护作用，对热不稳定，于含，巯基有保护作用，对热不稳定，于含50甘油的缓冲甘油的缓冲液液20保存；保存；2.识别序列识别序列多为回文结构，水

9、解磷酸二酯键，切端分平头多为回文结构，水解磷酸二酯键，切端分平头（钝端）和突出（黏性）末端两种（钝端）和突出（黏性）末端两种;3.回文回文可以倒读，举例可以倒读，举例： 池莲照晓月，幔锦拂朝风。池莲照晓月，幔锦拂朝风。 风朝拂锦幔，月晓照莲池。风朝拂锦幔，月晓照莲池。 限制性核酸内切酶举例限制性核酸内切酶举例（DNA指纹检测和指纹检测和Am-RFLP时用）时用）切出粘端切出粘端Hpa II 5-G CGC-3Bam H1 5 -TCCGGA-3Eco R1 5-G AATTC-3切出钝端（平端）切出钝端（平端）Alu I 5-AG CT-3Sma I 5-CCC GGG-3杂交及其条件杂交及其

10、条件（DNA指纹检测和指纹检测和HLA基因检测用基因检测用)1. 1.碱基配对的原则，碱基配对的原则，G/CG/C比比A/TA/T牢固（意义：退火温度要牢固（意义：退火温度要高）高）2. 2.变性变性复性的条件复性的条件3. 3.单链单链DNADNA的特性吸附在硝酸纤维素膜的特性吸附在硝酸纤维素膜( (nitrocellulose nitrocellulose membrane)membrane)或尼龙膜或尼龙膜( (nylon membrane)nylon membrane)上上4. 4.杂交条件的严谨性（温度杂交条件的严谨性（温度+ +、离子强度、离子强度- -、洗涤次数、洗涤次数+ +）

11、DNA复制的条件复制的条件（细胞中（细胞中/试管中比对）试管中比对）1.单链单链DNA模板模板（解链酶、（解链酶、DNA拓扑异构酶）拓扑异构酶）2.引物的特异性引物的特异性20 bases（细胞中引物酶合成细胞中引物酶合成RNA引物）引物）3.DNA聚合酶聚合酶（细胞中的（细胞中的DNA聚合酶聚合酶III）, 效率效率2500bp/s4.原料原料dNTPs5.合适的溶液（合适的溶液（Mg2+）6.DNA复制的方向：复制的方向：5 3 3检测基因产物多态性的局限检测基因产物多态性的局限 1 1基因产物易受外界因素干扰，不能持久（蛋白质结构，基因产物易受外界因素干扰，不能持久（蛋白质结构，抗原决定

12、族等易受破坏，改变，酶活性中心失活）抗原决定族等易受破坏，改变，酶活性中心失活）2. 2. 技术上的先天不足技术上的先天不足 HLA HLA的的AbAb与与AgAg各自都有广泛的交叉反应。使定型困难，各自都有广泛的交叉反应。使定型困难，或无法解释。或无法解释。3. 3. 遗传变异遗传变异 ABO ABO血型遗传变异血型遗传变异B+OAB+OA、Cis-ABCis-AB、O Oh h4. 4. 基因表达过程中影响因素多基因表达过程中影响因素多 生理病理过程基因表达受时，空（组织特异性）限制。生理病理过程基因表达受时，空（组织特异性）限制。5 5人的人的3 3万多个基因中只有万多个基因中只有5%5

13、%有活性。有活性。DNA 作为个人认定的基本条件作为个人认定的基本条件（生化基础）（生化基础） 1. 分别来自父亲和母亲分别来自父亲和母亲 受精卵受精卵DNA来自于精子和卵子来自于精子和卵子； 个体的生长来源于受精卵的分裂个体的生长来源于受精卵的分裂 胚胎胚胎 分化成组织器官分化成组织器官 成熟的个体。成熟的个体。 细胞不断分裂细胞不断分裂 ，DNA不断自我复制：严格按照半保留不断自我复制：严格按照半保留 法则，保证个体全部有核细胞的法则，保证个体全部有核细胞的DNA组成与受精卵的组成与受精卵的 完全一致完全一致 。 2.完全个体特异的完全个体特异的 DNA序列包含了人的序列包含了人的全部遗传

14、信息全部遗传信息。世界上没有。世界上没有 任何两个个体（单卵双生除外）的任何两个个体（单卵双生除外）的DNA序列完全相同序列完全相同。 DNA标记的优点标记的优点1. 多态性高：多态性高：DNA指纹指纹(DNA fingerprint)，5000 2万个万个STR位点，位点，1个个SNP位点位点/1kb，MVR-minsatellite; 单个单个STR位点的等位基因数量多；位点的等位基因数量多； 个体分辨率个体分辨率(discriminating power)高高2. 没有两个人没有两个人(单卵双生除外单卵双生除外)的的DNA序列是完全相同的序列是完全相同的;3. 干燥后可以长期保存（干燥后

15、可以长期保存（9400 y）;4. 线粒体线粒体DNA多拷贝（几个多拷贝（几个1000个），检测灵敏度高个），检测灵敏度高;5. DNA分析技术成熟，可机械化、自动化分析技术成熟，可机械化、自动化.二二. DNA分类及遗传规律分类及遗传规律1. 父母源性父母源性: chromosomal DNA2. 母源性：母源性：mitochondrial DNA(16569bp清楚清楚)3. 父源性：父源性：Y-chromosomal DNA(现已有现已有超过超过150个个STR位点位点具有多态性具有多态性)细胞核细胞核DNA：常染色体常染色体DNADNA性染色体性染色体DNADNA线粒体线粒体DNA人人

16、 类类 DNA 分分 类类 RBC(膜抗原及其中的酶) 基因(倾向保守) HLA 染色体DNA 编码 外显子 血清蛋白 (父母源) 调控区，内含子 同工酶 单拷贝(spacer) 卫星DNA(着丝粒周围) 串联重复串联重复 小卫星DNA(散在) 非编码 (VNTR10%) 微卫星DNA(STR)DNA 多拷贝 SINES(短) 分类 (重复序列) 散在重复 50000bp L1 线粒体DNA L2HS (母源) KpnI (父:10-4) 非编码区 D-LOOP(非重复序列非重复序列)多态性多态性(1) polymorphism多态性概念多态性概念：一个生物群体内，个体之间存在多种形态一个生物

17、群体内，个体之间存在多种形态(polymorph)的现象的现象。外在（相貌）和内在（血型外在（相貌）和内在（血型, DNA等）等）遗传多态性遗传多态性 genetic polymorphism : 遗传决定的遗传决定的。按基因座划。按基因座划分，低频等位基因分，低频等位基因 0.010.01。表型表型(phenotype)多态性多态性：表现型（基因产物）多态性表现型（基因产物）多态性DNA多态性多态性：DNA序列的个体差异，序列的个体差异，以相同基因座为单位进行比较以相同基因座为单位进行比较，分为序列差异和长度差异。分为序列差异和长度差异。 注意：注意：长度差异实质上属于序列差异长度差异实质上

18、属于序列差异。非遗传多态性非遗传多态性环境因素环境因素和非遗传性因素非遗传性因素造成的。如外伤缺指。温度影响龟、短吻鳄的性别：70 0F （ ），70 77 0F ( ），77 0F （ ）；环境影响一种海鱼的性别。 遗传性疾病不归入遗传多态性，如多指畸形，G6PD缺乏症；换血，换血，干细胞、骨髓移植干细胞、骨髓移植等。 基因座和等位基因的命名基因座和等位基因的命名1. 多态性基因座的命名多态性基因座的命名(nomenclature) D8S1179 D8代表第代表第8号染色体的号染色体的DNA片段片段 S 表示单拷贝表示单拷贝(single copy)片段片段 1179 WHO、Genban

19、k 给出的序号给出的序号2. 等位基因的命名等位基因的命名 按等位基因含有的按等位基因含有的重复单位（又称核心序列）数量命名重复单位（又称核心序列）数量命名 ,如如D8S1179 位点位点, 基因型基因型20/19, 表示一个等位基因含有表示一个等位基因含有20个重个重复单位复单位,另一个含有另一个含有19个重复单位个重复单位. (core sequence, repetitive unit) 特殊现象：特殊现象：TH01 20.3； Penta E 19.4； Short Tandem Repeats (STRs)the repeat region is variable between s

20、amples while the flanking regions where PCR primers bind are constant7 repeats8 repeatsAATGHomozygote = both alleles are the same lengthHeterozygote = alleles differ and can be resolved from one anotherPowerPlex 16 LaddersD3S1358D16S539D21S11D18S51Penta DD13S317CSF1POD7S820Penta ETH01D5S818VWAD8S117

21、9TPOXAMELFGA(9)(9)(25)(22)(20)(10)(9) (9)(9)(10)(14)(13)(12)(8)(27)13 CODIS Core STR Loci with Chromosomal PositionsCSF1POD5S818D21S11TH01TPOXD13S317D7S820D16S539D18S51D8S1179D3S1358FGAVWAAMELAMEL遗传标记举例遗传标记举例DNA多态性的分类多态性的分类(1)1. 片段长度多态性片段长度多态性(染色体染色体DNA，包括，包括X、Y染色体染色体DNA) 以重复序列为主以重复序列为主:VNTR, STR2.序

22、列多态性序列多态性 1) 线粒体序列多态性线粒体序列多态性 2) 基因多态性基因多态性: ABO血型血型, HLA 3) MVR序列多态性序列多态性 4) 单核苷酸多态性单核苷酸多态性(SNPs, single nucleotide polymorphism) (片段两翼的序列相同片段两翼的序列相同) 以上均指以某一以上均指以某一位点位点(locus)来考虑的，来考虑的， 线粒体线粒体DNA控制区则以控制区则以nt位置位置进行比对。进行比对。DNA多态性的分类多态性的分类(2)3. DNA指纹（指纹（DNA fingerprints） Jeffreys，AJ等等1985年发现的。其图谱是由使用

23、的核酸内切酶年发现的。其图谱是由使用的核酸内切酶和探针决定的。和探针决定的。 Jeffreys使用内切酶使用内切酶Hinf I、探针是肌红蛋白内含子一段重复序探针是肌红蛋白内含子一段重复序列（也可以用其他系列作探针）。但不是多位点（基因座）列（也可以用其他系列作探针）。但不是多位点（基因座）探针。探针。个体之间比较不能以基因座（个体之间比较不能以基因座（locus）的方式进行；的方式进行；其一次实验能达到的个体识别力接近辨认个体的水平。高于其其一次实验能达到的个体识别力接近辨认个体的水平。高于其他他DNA分析实验。分析实验。 有人将其归入有人将其归入“长度多态性长度多态性”，实际是不对的。，实

24、际是不对的。“ DNA fingerprints”重复序列的特点重复序列的特点The characters of the repetitive sequence1. 广泛分布广泛分布, 常在非编码区，内含子常在非编码区，内含子; （多属（多属卫星卫星DNA）2. 两翼的序列在两翼的序列在群体内相同，不同人种有差异群体内相同，不同人种有差异;3. 呈串连重复排列，呈串连重复排列，核心序列（核心序列（core sequencecore sequence） VNTR(variable number of tandem repeats): minisatellite(10bp), STR(short

25、tandem repeats)， microsatellite(26bp)4. 个体间：重复次数不同个体间：重复次数不同 核心序列不同核心序列不同 核心序列之间插入序列不同；形成多态性核心序列之间插入序列不同；形成多态性5. 遗传给子代（突变率高）遗传给子代（突变率高）片段长度多态性片段长度多态性(length polymorphism)特点特点: 1. : 1. 串联重复序列串联重复序列(tandem repeat);(tandem repeat); 2. 2. 同基因座的不同等位基因，核心序列同基因座的不同等位基因，核心序列(core sequence)(core sequence)数量不

26、同数量不同, ,因而表现为长度差异因而表现为长度差异. .卫星卫星DNA(DNA(串联重复序列串联重复序列),),其其G/CG/C含量高含量高, ,少数为少数为A/T,A/T,沉降系数偏沉降系数偏高或偏低高或偏低. . 小卫星小卫星 ( (minisatelliteminisatellite) DNA() DNA(核心序列核心序列 10-70 10-70bp)bp) 微卫星微卫星( (microsatellitemicrosatellite)DNA()DNA(核心序列核心序列 2-6 2-6bp)bp) 通过通过PCRPCR可以检测到。可以检测到。What are STRs? Short Ta

27、ndem Repeats (STR) are repetitive sequences: Tetranucleotide:AAAG AAAG AAAG AAAG Trinucleotide:CTT CTT CTT CTT CTT Dinucleotide:AG AG AG AG AG AG Tetranucleotides are favored in human identity Good balance of “ease of interpretation” and “variability found in nature”Short Tandem Repeats (STRs)the re

28、peat region is variable between samples while the flanking regions where PCR primers bind are constant7 repeats8 repeatsAATGHomozygote = both alleles are the same lengthHeterozygote = alleles differ and can be resolved from one another170 bp195 bpDifferent primer sets produce different PCR product s

29、izes for the same STR alleleTCAT repeat unit复杂重复序列举例复杂重复序列举例 AGATm GAT AGATn AGACo AGATp AGACq m=3 ， n=3 ，o=3，p=11，q=8PowerPlex 16 LaddersD3S1358D16S539D21S11D18S51Penta DD13S317CSF1POD7S820Penta ETH01D5S818VWAD8S1179TPOXAMELFGA(9)(9)(25)(22)(20)(10)(9) (9)(9)(10)(14)(13)(12)(8)(27)D8S1179D21S11D7S8

30、20CSF1POD3S1358TH01D13S317D16S539D2S1338D19S433D18S51TPOXVWAAMELD5S818FGAGS500 LIZ size standardMarker Name GenBank Accession Repeat Motif Allele Range PCR Product Sizes Reference DYS19 X77751 TAGA 8-16 178-210 bp Roewer 1992 DYS385 Z93950 GAAA 10-22 252-300 bp Schneider 1998 DYS388 G09695 ATT 12-17

31、 128-143 bp Kayser 1997 DYS389 I DYS389 II G09600 G09600 (TCTG) (TCTA) (TCTG) (TCTA) I: 7-13 II:23-31 239-263 bp 353-385 bp Kayser 1997 Kayser 1997 DYS390 G09611 (TCTA) (TCTG) 18-27 191-227 bp Kayser 1997 DYS391 G09613 TCTA 8-13 275-295 bp Kayser 1997 DYS392 G09867 TAT 7-16 236-263 bp Kayser 1997 DY

32、S393 G09601 AGAT 9-15 108-132 bp Kayser 1997 YCAIII AC006370 CA 19-25 192-204 bp Kayser 1997 DYS434 AC002992 ATCT 8-11 110-122 bp Ayub 2000 DYS435 AC002992 TGGA 9-13 210-228 bp Ayub 2000 DYS436 AC005820 GTT 10-15 128-143 bp Ayub 2000 DYS437 AC002992 TCTA 8-11 186-202 bp Ayub 2000 DYS438 AC002531 TTT

33、TC 6-12 203-233 bp Ayub 2000 DYS439 AC002992 AGAT 9-14 238-258 bp Ayub 2000 Y-GATA-A4 G42670 AGAT 11-14 242-254 bp White 1999 Y-GATA-A7.1 G42675 ATAG 7-12 161-181 bp White 1999 Y-GATA-A7.2 G42671 TAGA 8-12 174-190 bp White 1999 Y-GATA-A8 G42672 TCTA 8-14 219-244 bp White 1999 Y-GATA-A10 G42674 TATC

34、11-14 160-172 bp White 1999 Y-GATA-C4 G42673 TATC 11-16 251-271 bp White 1999 Y-GATA-H4 G42676 TAGA 10-13 362-370 bp White 1999 Y-STR MarkersJ.M. Butler, Forensic DNA Typing, Table 8.1DNA序列多态性序列多态性 1. 线粒体序列多态性线粒体序列多态性 2. 基因多态性基因多态性: ABO血型血型, HLA 3. MVR序列多态性序列多态性 4. 单核苷酸多态性单核苷酸多态性(SNPs, single nucleo

35、tide polymorphism) (片段两翼的序列相同片段两翼的序列相同) 5. 其他其他 以上均指以某一以上均指以某一位点位点(locus)来考虑的来考虑的 序列多态性序列多态性 D-loop区域区域 长度多态性长度多态性 nt514-nt523：CA重复重复 C-stretch: polyC 9bp DelitionmtDNA序列多态性序列多态性mtDNA 序列的表示方法（例：序列的表示方法（例：Andersons sequence）序号序号nt序号序号nt序号序号nt序号序号nt序号序号nt 五五. DNA多态性的成因多态性的成因1. 细胞分裂过程染色体细胞分裂过程染色体DNA的交换

36、重组的交换重组 (crossover/recombination)；2.细胞减数分裂前细胞减数分裂前,具有同源序列的两个具有同源序列的两个DNA片段片段 进行同源重组进行同源重组(homologous recombination);3. 转座子的转座现象转座子的转座现象(transposition)（见分子遗传学与基因工见分子遗传学与基因工 程程）；）；4. 基因的突变：点突变基因的突变：点突变(point mutation)，缺失缺失(deletion) /插入插入(insertion)，DNA重排重排(rearrangement), DNA复制滑动等复制滑动等5. 最近（最近（06421）

37、美英科学家发现人类染色体有许多）美英科学家发现人类染色体有许多“跨染跨染色色 体重组体重组”现象（染色体之间的互动），亦是可能原因。现象（染色体之间的互动），亦是可能原因。Steps in DNA Sample ProcessingBiologyDNAExtractionDNAQuantitationPCR Amplificationof Multiple STR markersTechnologySeparation and Detection of PCR Products(STR Alleles)Sample Genotype DeterminationGeneticsCompariso

38、n of Sample Genotype to Other Sample ResultsIf match occurs, comparison of DNA profile to population databasesGeneration of Case Report with Probability of Random MatchSample Obtained from Crime Scene or Paternity InvestigationPower of Discrimination Through MultiplexingAllelepossibilitiesSampleGeno

39、type1 in 181 locus:1 in 181 in 50X3 loci:1 in 180001 in 20X2 loci:1 in 360Hypothetical likelihood of occurrence1 in 44X4 loci:1 in 7920009 loci: 1 in 101016 loci: 1 in 1017Current World Pop: 6.3 billion结束Commonly Used TermsAllele: An alternative form of a gene.Allele Frequency: The proportion of a p

40、articular allele among the chromosomes carried by individuals in a population.Homozygosity: The presence of the same alleles at one or more loci on homologous chromosomes.Heterozygosity: The presence of different alleles at one or more loci on homologous chromosomes.Locus (pl. Loci): The position of

41、 a gene or chromosome segment on a chromosome. Alleles are located at identical loci on homologous chromosomes.Mixture: The presence of two or more contributors to a given sample.Multiplexing: A PCR approach that amplifies several alleles simultaneously, greatly increasing throughput.Short tandem re

42、peats (STR): Multiple copies of an identical DNA sequence arranged in direct succession in a particular region of a chromosome.PowerPlex 16 SystemProduct Overview5 bpAdvantages of Pentas vs. Tetranucleotides:Less Stutter artifactsHighly discriminating lociGreater separation of individual allelesFewe

43、r MicrovariantsPentanucleotidesHomozygote = both alleles are the same lengthHeterozygote = alleles differ and can be resolved from one anotherShort Tandem Repeats (STRs) Repeat region is variable (polymorphic) Each variant is referred to as an allele Flanking region is constantKEY: Alleles are disti

44、nguished by length7 repeats8 repeatsAATGCurrent Forensic STR Multiplexes PowerPlex 16 and PowerPlex 16 BIO100 bp500 bp200 bp300 bp400 bp600 bpTH01D3D21D18Penta ED5D13D7D16CSFPenta DAvWAD8TPOXFGA100500200300400600Allele CallsHuman Identity TestingApplications Forensic cases: matching suspect with evi

45、dence Paternity testing: identifying father Convicted felon DNA databases Missing persons investigations Mass disasters - putting pieces back together Historical investigations Immigration Military DNA “dog tag”DNA Use in Forensic Cases Most are rape cases (2 out of 3) Looking for matches between ev

46、idence, victim, and suspect Must compare DNA profilesChallengesOverview of PowerPlex 16 System Single Amplification Systems 13 CODIS loci, 2 penta loci, Amelogenin PowerPlex 16 validated for SpectruMedix platforms PowerPlex 16 fully validated for CODIS/NDIS casework and database applications PowerPl

47、ex 16 Released May 2000 Matching Probability of 1:1x1017 - 1:1x1018Human Identity MarketSummary Made up of local, state, and federal law enforcement agencies as well as private reference and paternity labs Often resistant to change due to validation requirements and shortage of time and resources fo

48、r retraining Greatest influence comes from use and validation by other agencies, esp. within their state or FBI stamp of approval May require significant up-front handholding until validated Hungry for alternative to AB reagents and instrumentation MVRMVR核心序列核心序列片段长度相同片段长度相同, ,个别碱基不同个别碱基不同 Type1: CA

49、C AAT ATA CAT GAT GTA TAT TATA Type1a: CAC AAC ATA CAT GAT GTA TAT TATA Type2: CAC AAT ATA CAT GAT GTA TAA TATA Type3: CAC AAT ATA CAT CAT GTA TAT TATA Type3a: CAC AAT ATA CAT CAT GTA TAA TATA Type4: CAT AAT ATA CAT CAT GTA TAT TATA Type4a: CAT AAC ATA CAT CAT GTA TAT TATA Type5: CAT AAT ATA CAT GAT

50、 GTA TAA TATA Type6: CAC AAT ATA CAT CAT GTA TAA TATA Type7: CAC AAT ATA CAT CAT GTA TAT TATA 辐射：辐射：-，-，-射线，射线，X-ray，中子，质子及紫外线中子，质子及紫外线化学诱变化学诱变：乙酰亚胺（：乙酰亚胺（ethylenimine）及其衍生物，杀虫剂，及其衍生物，杀虫剂， 石油工业产品，诱染色体畸变三乙硫代磷酰胺（石油工业产品，诱染色体畸变三乙硫代磷酰胺（thiotepa） 染料，防火，防水，染色体畸变染料，防火，防水，染色体畸变 芥子气（芥子气（mustard gas）; 塑料业，畸胎，致

51、癌，诱变塑料业，畸胎，致癌，诱变; 亚硝酸（亚硝酸（nitrosamine）, 烟草中，致癌、诱变烟草中，致癌、诱变; 乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTA）, Captan 杀真菌剂杀真菌剂, 致畸胎致畸胎; 链霉黑素（链霉黑素（streptonigrin）抗生素、癌化疗剂，致癌、诱抗生素、癌化疗剂，致癌、诱变变 AF-（呋喃糖酰胺呋喃糖酰胺 furylfuramide） 食品添加剂：（食品添加剂：（豆腐、火腿、香肠中的）豆腐、火腿、香肠中的）致癌、诱变、染色体畸致癌、诱变、染色体畸变变 试剂：丙稀酰胺、联苯胺、溴乙锭等试剂：丙稀酰胺、联苯胺、溴乙锭等 DNA复制时出现的差错：复制时出现的差

52、错：常见于线粒体的异质性常见于线粒体的异质性DNA in the CellTarget Region for PCRchromosomecell nucleusDouble stranded DNA moleculeIndividual nucleotidesDNA分析技术的成熟 PCR技术的发明 相应自动化仪器（DNA分析仪）和应用软件的商品化；相应的DNA分析用试剂盒的商品化；分析技术进入普通实验室，成为常规检测手段。Make copies (extend primers)Starting DNA Template55335533Add primers (anneal)5335Forwar

53、d primerReverse primerDNA Amplification with the Polymerase Chain Reaction (PCR)Separate strands (denature)5533In 32 cycles at 100% efficiency, 1.07 billion copies of targeted DNA region are createdPCR Copies DNA Exponentially through Multiple Thermal CyclesOriginal DNA target regionThermal cycleThe

54、rmal cycleThermal cycleHypothetical pedigreeindicating some of the relatives of a person who could be used for identification 线粒体线粒体DNA分析在法医学上的应用分析在法医学上的应用 单纯样本的图形为单峰单纯样本的图形为单峰 对于混合样本，如为同一人，则图形也为单峰对于混合样本，如为同一人，则图形也为单峰; 混合样本，如非同一人，则图形为多蜂混合样本，如非同一人，则图形为多蜂.两份两份DNA样本的比对结果样本的比对结果所谓的基因身份证身份证的基本要求人类基因序列的复杂

55、性目前人类掌握的技术水平各个实验室之间的差异混合样本（样本1和2），分别来自不同个体HVI A1B1 57.9CForensicsTime (Minutes)7654321Absorbance (mV)11109876543210 4.39 4.70 5.02标准样本(refernce sample)未知样本1未知样本2+ Reference未知样本一+ Refernce未知样本二Sample alone with reference 1 with reference 2 with reference 3Sample 1 mtDNA profile A1B2Sample 2 mtDNA profile A1B2Time (Minutes)7654321Absorbance (mV)87654321Time (Min