治疗性单抗研究进展与抗体产业关键技术

1、治疗性单抗研究进展与抗体产业关键技术 发布时间： 2013-6-21 抗体作为机体免疫应答的效应分子，能够 识别、中和或清除诱发疾病的抗原。抗体的 可变区 (Fab)可特异性的结合抗原或靶细胞；抗体的恒定区”(Fc)介导多种细胞效应功能(CDC ADCC等)此外，Fc端与FcRn的结合，使得抗体分子在体内的 半衰期长达十至二十天。以上抗体的分子结构与 生 物功能保证了其作为治疗性蛋的药用疗效。 98 截止 2012 年底，欧美市场已有总计三十余种治疗性抗体 上市销售(见图 1)。以上抗体药物已经在免疫性疾 病1、癌症 2等治疗领域取得巨大成功。而 从抗体 药物的研发线来看，已经有三百余种单抗药

2、物进入 临床研究阶段 3。抗体药物研制的成功率( 20%)远 远高于传统小分子化学药( 11%) 4。所 以，抗体 药物已经成为，并且未来仍将是制药行业发展的主 要方向 5。 1 抗体技术与抗体药物的发展进程 1.1 抗体技术的发展进程 抗体在临床上的治疗性应用， 始于1888年Emile Roux使用多克隆抗体治愈白喉 病患者。 1897 年 Paul Ehrlichs 提出了 魔术子弹 (magic bulle)t 的假说：即利用抗体进行 靶向治疗 利用抗原免疫动物可以快速获得含有多克隆抗体的 抗血清 。但是由于多克隆抗体本质上是针对抗原不 同 表位的单克隆抗体混合物，其质量并不均一，加

3、之受免疫动物的制备路线所限，多克隆抗体在临床 上的应用并不多见；上世纪七十年代，利用小鼠 B 淋巴杂交瘤细 胞，可以获得抗单个抗原决定簇的 单 克隆抗体 ，后者较多克隆抗体特异性高、均一性好， 成本低廉，为抗体技术的临床应用带来突破 6。 上 世纪八十年代，美国 Gentech 公司申请了关于 重组 抗体制备的首个专利（Cabilly patent专利），即利 用 DNA 重组技术，将抗体重链、轻链 DNA 同时导入 宿主细胞，后者合成并分泌具有生物活性的单克隆 抗体。此后，治疗性抗体的生 产真正进入到产业化 阶段。另外，基因工程抗体能够在基因水平对抗体 分子进行切割、拼接，组装，赋予抗体分子

4、新的生 物活性，较 多克隆抗体 杂交瘤单抗 更具应用前景。 1.2 抗体药物的发展进程 1986 年，采用杂交瘤技术 生产的”鼠源单抗0KT3TM （muromonab）成为上市 的首个治疗性单抗。但是，由于鼠源单抗严重的免 疫原性（人抗鼠抗）问题。抗体药物在上市的首个 十年间临床应用并不广泛。 此后， 嵌合抗体 技术 保留鼠源Fab,采用人源Fc段替代鼠源Fc端，部分 减轻了鼠源抗体的免疫原性。CDR移植技术又可将 可变区的部分序列更换为 人源序列，进一步的减轻嵌合抗体的免疫原性，采用此技术的抗体药物称之 为人源化抗体（humanized antibody）。由于成功的降低了 重组抗体的免疫

5、原性，上世纪九十年代末上市的诸 多嵌合抗体和人源化抗体，得以在临床上广泛应用。 嵌合抗体 的人源程度可达 66%，人源化抗体 可达 90-95%，但仍不是真正意义上的 人源抗体 。上世纪 八十年代发展起来的 体外展示技术 （噬 菌体、酵 母菌、核糖体展示等） ，通过构建大容量人源抗体文 库，可实现全人源抗体的体外筛选 7（如 2002 年上 市 Adalimumafc）。本世纪初兴起 的的转基因鼠技 术 TMTMTMTM （ 如 ： HuMAb-Mouse、 KM-Mouse、 XenoMouse VelocImmune 等），在小鼠体内转入 了人的抗体基因簇，经抗原免疫后也产生全人源抗 体8

6、（如 2006tm年上市的 Panitumumab）。此外， 近年来出现兔单抗技术（如 RabMAb），较传统鼠 源抗体亲和力强、特异性高，也是成为抗体药物设 计的一种选择 9。从目前以上市抗体的结构分析， 人源化抗体及全人源抗体已经成为抗体药物的主流 10（见图 1）。注：鼠源单抗： -omab ；嵌合抗体：-ximab; 人源化单抗： -zumab ; 人源单抗： -umab; 融合蛋白： -cept图 1 抗体技术与抗体药物发展历程(数据截止至 2012 年 12 月) Fig.1 The development progress of antibody technology and a

7、ntibody drug (Date current as December 2012) 目前抗体药物开发的最新趋势体 现在：一是，在原有药物靶点基础上，利用 抗体工程技术，提高单抗药物的疗效 11 (见图 2)；二是， 构建抗体免疫连接 物、抗体片段、双特性抗体，或 新型结构的抗体药物。如： 2007 年上市的 Soliris(Eculizumat),其 Fc端为 IG2/4 的嵌合体12; 2009 年上市的三特异性抗体RemovabTM,可变区可同时 结合肿瘤靶点和CD30受体。12国内外抗体药物产业现状 2.1 国际上抗体产业现状 2009 年美国 市场上的抗体药物成为生物技术药物销售

8、额最大的类 别。此后数年，抗体药物的销售额均保持在6-8%的增长率。 2010 年美国市场的单抗药物 销售额为 185 亿美元，世界范围内单抗药物销售额总计已达 400 多 亿美元，约是整个生物制药市场份额的36%13。在已上市的单抗药物中，销售额排名 前五位的单抗品 种，为整个抗体药物市场贡献着 82%的市场份额。因 此，抗体药物的品种上 有 所 谓 Big 5 之 说 ( 即 ： bevacizumab、 trastuzumab 、 adalimumab、 infliximab， rituximab)。据预测，2014 年 adalimumab和 bevacizumab将成为 世界上销 售

9、量最大的药物品种 14。 在国际制药行 业，一方面，传统制药公司通过兼并建立其在抗体 药物上的产品线，如：强生收购 Centoco,罗氏收购 Immunex、Genentech 等；另一方面大型药企通过组 建自己的抗体药物研发平台，以保持其在单抗药物 开发上的技术优势。如 Seattle Genetics重点发展抗 体免疫连接物，15。GSK和 Boehringer Ingelheim 通过并购，建立 双特异性抗体 药物研发平台 16。随着抗体原研药物相关专利的到期，欧盟、美国开始考虑审批抗体仿制药。2010年11月，EMEA也出 台了生物仿制药的草案，2012年2月FDA也颁 布了生物仿制药

10、指导原则草案 ，两者均开始建立 以生物相似度 为核心的生物仿制 药审批流程，这 些都为抗体仿制药的审批铺平道路。而在政策相对 宽松的亚 TM 洲，我国、印度、韩国均已有抗体仿制 药上市。印度 Dr.Reddy公司的 RedituxrM售价仅为原 研药物 Rituxan 成本的十分之一 17。我国市场上也 出现仿制药益 TMTM 赛普、强克与原研药物 EnbrelTM 竞争的局面。 2.2 我国抗体产业发展现状 我国的抗 体药物产业尚处起步阶段，近十年间国内先后涌现 出后中信国健、百泰生物、成都弘康、上海赛金等 多家专门从事单抗药物生产的企业。同时，许多传 统制 药企业（哈药、海正、华药、先声等

11、）也开始 涉足抗体药物领域。特别是近两年，服务抗体药物 开发的 CRO/CMO 公司（药明康德、义翘神州、中美 奥达等）开 始出现。标志着新兴的抗体产业在我国 已初现雏形。 但是，无论从上市品种，还是从行业 产能，技术水平等方面分析，我国的抗体产业的发 展尚处于起步阶段。目前我国的上市抗体品种中 （见表一），国外进口单抗占 据多数，我国市场上唯 一全人源抗体（Adalimumab）为国外公司（Abbott） 进口，上述 Big 5单抗药物在国内均已上市；我国自 主研发的六种抗体药物，以鼠源、嵌合、人源化为 主，多集中在少数靶点上（ TNF、 EGFR，CD25 等）。 这就意味着 相同临床适应

12、症上，将面临国内外不同 厂家的品种竞争。 Table 1 The analysis of approved therapeutic antibody in Chin表一我国上市抗体药物 品种分析14 主要适应商品名 靶点 类型 开发厂家 备注 症 自主靶点利卡汀 鼠源 肝癌 成都华神 CD147 HAb18G/CD147嵌合唯美生核蛋白实体瘤上海美恩 嵌合 类克（ Infliximab） 银屑病 2012 年全球销量 TNF J&J2076 百万美元 修美乐 2012 年全球销量人源 类风湿 TNF Abbott (Adalimumab) 9265 百万美元 融合 蛋强克 类风湿 上海赛金 仿

13、EtanerceptTNF白 融合蛋 益赛普 类风湿 中信国健 仿EtanerceptTNF白2010年 市场销量 Merck 爱必妥 (Cetuximab) 嵌合 直肠癌 EGFR 1781万美元GaA同靶点已有嵌合/人泰欣生 人源化 鼻咽癌 百泰生物EGFF源抗体 赛尼哌2005年 全球销量 26 人源化 免疫抑制 罗氏 CD25 百万美元 (Daclizumab)健尼哌人源化免疫抑制中信国健仿 DaclizumabCD25美罗华2012年全球销量嵌合 淋巴 瘤 罗氏 CD20 (Fituximab) 6449 百万美元 安维汀 2012 年 全 球销 量 罗 氏 人源 化 直肠 癌 VE

14、GF (bevacizumab) 5543百万美元 赫赛汀 2010年市场 销 量 罗 氏 人 源 化 乳 腺 癌 HEF2 5859 万 美 元 (trastuzumab)舒莱但asiliximab)嵌合免疫抑制诺华CD25 更为重要是，治疗性抗体作为大剂量重组蛋 白药物。一个年销售额过亿美元的单抗药物，往往需 要年产百公斤级重组蛋白的产能做支撑。行业的技术 水平与产能规模 将直接影响上市抗体的成本与盈利。 我国抗体行业普遍存在着细胞系表达水平低，培养规 模小、纯化能力不够等技术问题 18 19, 20 。以上诸 多产业化关键技术 限制了我国抗体产业的产能规模， 制约了行业的发展进程(见图

15、2)。3 抗体产业关键技术 目前国际上抗体药物的生产 成本一般控制在 500 美元 /g 以下。为此，相应的产 业化技术水平要达到以下指标：细胞系表达能 力20pcd （pg /cell/day）,大规模培养工艺抗体表达 水平在1-5g/L,下游纯化能力在 50100kg/batch,纯 化收率在 70%以上21 22。 3.1 工程细胞系的构建 能够正确表达重组抗体的细胞系，还需具备生长能力强，表达水平高、遗传稳定性等特性，才能成为具有产业化价值的 工程细胞系 23。国内目前抗体 表达水平普遍偏低（1g/L）,其根本原因在于细胞系 生产能力的不足（v 20pcd）。在宿主细胞的选择上，除了少

16、数鼠源抗体 仍由骨髓瘤细胞（NSO、sp2/0）生产外，绝大多数抗体药 物均由CHO细胞生产。近年来，Crucell公 司开发的 人视网膜细胞系PER.C6TM，借助病毒载体能够实现 重组抗体的高表达； Merck 公司开发的酵母 GlycoFi TM，具备了抗体的特异性糖基化修饰能力23。宿主细胞的遗传改造主要集中在借助于 细胞工程 技术 提高细胞的生长能力和表达水平。如：通过导入抗 凋亡蛋白基因（bcl-2、bcl-x）,使宿主细胞具有更强 的生长能力 24；通过构建 自分泌细胞 表达生长因 子，使宿主细胞更适合无血清培养；通过过度表达 二硫键异构酶及相关分子伴侣 （Bip/GRP78，E

17、Rp57）， 提高宿主细胞对异源蛋白的折叠、分泌能力，等等。 25 业内在细胞构建中多使用的 基因共扩增体系 （如：DHFR/CHO DG44 GS/CHOK1，在基于此原理 的重组细胞筛选过程中，易出现目的基因拷贝丢失、 克隆间差异性差等问题，为此可采用了 弱化筛选基 因、双 筛选基因 26 27等多种改良策略。此外， 已经出现多种商品化载体功能元件，能够克服载体 随机整合 时的 位置效应 ，如：强迫目的基因表达 的侧翼元件 STARTM、UCOEsTM、MARsTM 等；用于 目的基因定点整合的Flp - InTM技术，以及源自逆 转录病毒的新型载体 GPExTM等28, 29。在克隆筛

18、选环节，传统的 有限稀释法 正在被流式细胞仪自 动分选 或高 通量筛 选设 备（ 如 clonePixTM， CellCelectorTM CelloTM）所代替30。此外，工程 细胞系的筛选策略，也由单一以表达水平为依据， 也开始 转向综合评价细胞的生长能力 31 32、生产 能力、产物质量 33等多方面因素。 3.2 细胞大规模 培养工艺开发 目前，国际上重组抗体的制备主要采 用动物细胞培养工艺，其容积产率一般可达 3-5g/L 27（最高可达13g/L34）。大型制药企业的培养规 模超过二十万升（ 如 ： Amgen 公司 200,000L，Genentech公司250,000L等）21

19、，国内重组抗体生 产水平低于1g/L，流加培养规模不超过 3,000L仲 信国健），灌注培养规模不超过（ 500L）18, 19。动物细胞用培养基逐渐由 无血清培养基 或 无动物 来源培养基 转向 化学明确培养基 35。在培养基 优化策略上，除了传统的 组分滴定 、培养基混合 、 消耗成分分析 ， 化学计量法 外36，目前更多的 倾向于综合上述方法优 点的 理性培养基优化 37和 系统培养优化 38。此外， 借助迷你反应器 （ BioLectorTM、 SimCellTM、 Micro-24TM,ambrTM 等），可实现高通量实验设计 39。 流加培养模式是 目前重组抗体生产的主流方式，其配

20、套反应器多为 搅拌罐和气升罐。近年来兴起的一次性反应器（waveTM、Hyclone S.U.BTM等）多用于扩增种子细 胞或制备小规模样品。流加培养存在营养物质消耗、 代谢废物积累，以及产品质量不稳定等问题，因此 其工艺优化集中在基础 培养基、流加培养基以及流 加策略上40 41 42。灌注培养模式下，细胞密度、蛋白产量可较流加模 式提高数倍 43, 44。但是该工艺需使用细胞截留需 特殊装置（如旋转滤器、倾斜沉降装置、超声截留 装置等） 45，这就限制了其工艺的可操作性和放大 性。灌注培养工艺 的优化策略为通过优化培养基组 分，降低灌流速度，提高产物容积收率 46。 细胞培 养工艺中的物理

21、条件（温度、pH、渗透压等）、营养 成分等均会重组抗体的质量（聚体 47、糖基化 48， 电荷变异等 49 50）影响。因此，建立用于上市抗 体生产的细胞培养工艺，需要事先对其进行充分的 定性研究 ，以确定各工艺参数的控制范围 51 52。 3.3 大剂量重组蛋白纯化、质控 随着产业上游培养规 模（10, 000L）、抗体产率（5g心的提高。下游 纯化纯化环节的处理能力成为限制产能的 瓶颈。另 外，纯化 环节介质的成本占据抗体药物的生产成本 的 70%以上。规模、成本上的压力使得业内普遍认 为：未来下游纯化将是制约抗体行业扩大产能的主 要因素 53。 目前，业内普遍采用一条抗体纯化生产 线，与

22、数个发酵罐配套的设计方案。细胞收液通常 采用微滤、离心、深层过滤等方法实现 固液分离 ， 通过亲和色谱（protein A, protein G）捕获抗体。 然后再使用 精制色谱 （阴离子交换色谱、阳离子交 换色谱、疏水色谱等）进一步去除宿主蛋白、宿主DNA、色谱配基等杂质。此外，FDA要求整个纯化 过程中需配有至少两步病毒灭活步骤。 54 目前使用 的 亲 和 色 谱 （ Prosep vATM 、 MabSelectTM、MabCaptureTM),其抗体捕获能力通常在1550g/L由于柱色谱 不能无限制放大，其产能放大存在 限 制。新兴的一次性 膜色谱 技术，如 Q 膜色谱技术(如 Si

23、ngSepQ TM)处理能力可达 1036kg/L 55, 具有潜在的应用价值。 抗体分子在整个制备工艺中 存在多种降解途径,如：裂解、二硫键错配、甲硫 氨酸氧化、谷氨酸焦谷氨酸化、天冬酰胺脱乙酰化、 天冬氨酸异构化等,上述降解途径 会导致重组抗体 在分子量、纯度、等电点、糖基化等方面出现异质性,并最终影响抗体药物的临床疗效56。因此,抗体药物的质控需根据临床疗效确定其 关键质量属 性(Critical quality attribute),并据此确定抗体药物 的工艺过程、质量标准。 四 结语 我国于 2011 年已 经成为世界第三大医药市场。国内对于抗体药物的 市场需求巨大。生物制药产业也因

24、此被列为我国十 二五期间的战略性新兴产业。基于抗体抗体 的生物 制药产业将是未来国家培育的重点行业。近年来， 国家先后建立 抗体药物国家工程中心 (上海)、 抗 体药物研制国家重点实验室 (石家庄)等国家级 重 点实验室，行业内部业内也自发形成 抗体产业联盟 等组织。市场需求的驱动、产业政策的扶持，都为 我国抗体产业发展提供了良好的机遇。一旦在上述 产业关 键技术上取得突破，我国的抗体产业必将十 年之内有一个跨跃式的发展！ (来源：生物谷)1Chan AC, Carter PJ. Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation.

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