6、大肠杆菌菌浓的测定及发酵罐实验的了解

1、 实实 验验 六六大肠杆菌菌浓的测定大肠杆菌菌浓的测定及发酵罐实验的了解及发酵罐实验的了解目的要求目的要求n学习比浊法测量细菌数量的方法；学习比浊法测量细菌数量的方法；n学习空气浴摇床的使用方法；学习空气浴摇床的使用方法；n学习分光光度计和离心机的使用方法；学习分光光度计和离心机的使用方法；n掌握菌浓和菌体干重关系曲线的测定方法；掌握菌浓和菌体干重关系曲线的测定方法；n了解通用发酵罐的基本结构。了解通用发酵罐的基本结构。n了解发酵罐实验的一般流程及注意事项。了解发酵罐实验的一般流程及注意事项。n微生物生长曲线的测定微生物生长曲线的测定n比浊法比浊法n干重法干重法n菌落计数法菌落计数法n血球计数

2、板计数法血球计数板计数法n 菌浓菌浓OD600与菌干重的对应关系与菌干重的对应关系n将大肠杆菌用将大肠杆菌用LB培养基进行培养，在快速生长中期取样，分别用培养基进行培养，在快速生长中期取样，分别用去离子水（新鲜去离子水（新鲜LB培养基）稀释至不同浓度，分别测定培养基）稀释至不同浓度，分别测定OD600值。值。同时取同时取10mL菌液，菌液，8000rpm离心离心5min后，弃菌液，并用无菌水重后，弃菌液，并用无菌水重悬洗涤、离心悬洗涤、离心2次，次， 80下烘干至恒重后，测得干重。下烘干至恒重后，测得干重。n菌浓与菌浓与OD600的对应关系如下图所示。的对应关系如下图所示。n经数据拟合，线性良

3、好。经数据拟合，线性良好。大肠杆菌菌浓OD600与菌干重的关系曲线编号样品浓度（g/L）OD600离心管空重（g）离心管+菌 重量（g）01230.00.30.60.91.2 Dry cell weight (g/L)OD600实验材料实验材料n菌种菌种： 大肠杆菌。大肠杆菌。（老师提前准备菌种和用于菌体干重测定（老师提前准备菌种和用于菌体干重测定的菌液）的菌液）n仪器和其它物品仪器和其它物品： 722 722型分光光度计，空气浴振荡摇床，离心机，比色皿，型分光光度计，空气浴振荡摇床，离心机，比色皿，试管，移液器、枪头、离心管等。试管，移液器、枪头、离心管等。 上次灭菌的肉膏蛋白胨液体培养基。

4、上次灭菌的肉膏蛋白胨液体培养基。n发酵罐发酵罐n发酵发酵培养基培养基n发酵菌种发酵菌种n火圈火圈实验内容分配实验内容分配n每每4人人一组一组n每组建立一个菌浓和每组建立一个菌浓和OD600关系曲线。关系曲线。分光光度计的实验分光光度计的实验n空白对照空白对照n吸光度和透光度吸光度和透光度n吸光度值的适用范围吸光度值的适用范围离心机的使用离心机的使用n离心管平衡离心管平衡! !n离心效果与转速、时间的关系离心效果与转速、时间的关系【实验内容实验内容】n1. 离心管称重离心管称重n将一干净将一干净15ml 离心管，用分析天平准确称重并记录。离心管，用分析天平准确称重并记录。n2. 菌液离心菌液离心

5、n将老师准备好的大肠杆菌摇瓶，准确吸取菌液将老师准备好的大肠杆菌摇瓶，准确吸取菌液10ml加至已称加至已称重的离心管内重的离心管内(取液前将培养液振荡，使细胞均匀分布取液前将培养液振荡，使细胞均匀分布) 。与。与另一加水的相同离心管进行配平。另一加水的相同离心管进行配平。8000rpm离心离心5min，弃去，弃去上清，加去上清，加去10ml离子水重悬菌体，离心。再重复上述洗涤操离子水重悬菌体，离心。再重复上述洗涤操作作1次。弃去水溶液，将带有菌体的离心管在次。弃去水溶液，将带有菌体的离心管在80烘干至恒烘干至恒重。准确称重并记录。重。准确称重并记录。【实验内容实验内容】n3. 菌液稀释菌液稀释

6、n将老师准备好的大肠杆菌摇瓶，吸取一定体积的菌液至试管将老师准备好的大肠杆菌摇瓶，吸取一定体积的菌液至试管中，在不同试管中按不同比例进行稀释。（至少中，在不同试管中按不同比例进行稀释。（至少5个水平）个水平）n4. 测定吸光度测定吸光度n用未接种的肉膏蛋白胨液体培养基作空白对照，选用用未接种的肉膏蛋白胨液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。最好使其光密度值在波长进行光电比浊测定。最好使其光密度值在0.10.7之内之内(测定测定OD值前，将待测定的样品液振荡，使细胞均匀分布值前，将待测定的样品液振荡，使细胞均匀分布)。n做一个以去离子水稀释的对比试验（以去离子水做空白对做一个

7、以去离子水稀释的对比试验（以去离子水做空白对照），看照），看肉膏蛋白胨肉膏蛋白胨培养基对培养基对ODOD600600吸光度的影响。吸光度的影响。通用发酵罐的基本结构通用发酵罐的基本结构在你所见到的实在你所见到的实验室发酵罐上是验室发酵罐上是否找到对应功能否找到对应功能的部件？的部件？发酵罐实物图发酵罐实物图n控制主机n罐体n通气系统n空压机、通气管、流量计n搅拌系统n电机、搅拌桨、挡板n控温系统n升温、降温n传感器npH、温度、溶氧、泡沫n补料系统n消泡系统n取样口、接种口发酵实验的一般操作过程发酵实验的一般操作过程n准备菌种（大肠杆菌）n准备培养基n校准电极（pH、溶氧）n发酵罐（含培养基）灭菌n接种n发酵及取样分析（24h）n下罐发酵取样记录表格发酵取样记录表格标号标号发酵时