3 蛋白质结构分级和获取

1、蛋白质组学（蛋白质组学（Proteomics) )主讲人：肖飞主讲人：肖飞中心法则GenomicsTranscriptomicsProteomics蛋白质组学（蛋白质组学（Proteomics)Proteomics)是后基因组时代演进的核是后基因组时代演进的核心，是从整体水平上分析一个有机体，细胞或组织心，是从整体水平上分析一个有机体，细胞或组织的蛋白质组成及其活动规律的科学。的蛋白质组成及其活动规律的科学。教学目的和要求教学目的和要求 对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。 推荐教材推荐教材D. Liebler (1999)

2、 Introduction to Proteomics: Tools for the New BiologyR. Twyman (2006) Principles of Proteomics钱小红和贺福初钱小红和贺福初 （2003）蛋白质组学理论与方蛋白质组学理论与方法法陈主初和肖志强陈主初和肖志强 疾病蛋白质组学疾病蛋白质组学推荐教材推荐教材何华勤何华勤 （2011）简明蛋白质学简明蛋白质学学术期刊学术期刊学术期刊学术期刊学术期刊学术期刊学术期刊学术期刊蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究技术蛋白质双向电泳技术蛋白质双向电泳技术生物质谱鉴定蛋白质技术生物质谱鉴定蛋白质技术蛋白质翻译后修饰蛋白质翻

3、译后修饰蛋白质组学的定量研究技术蛋白质组学的定量研究技术蛋白质结构分析技术蛋白质结构分析技术互作蛋白质组相互技术互作蛋白质组相互技术蛋白质组信息学蛋白质组信息学蛋白质的分级结构蛋白质的分级结构 蛋白质的立体结构是有规律的蛋白质的立体结构是有规律的蛋白质结构的形成及稳定性是受物理原理控制的蛋白质结构的形成及稳定性是受物理原理控制的 蛋白质的功能与结构密切相关蛋白质的功能与结构密切相关蛋白质结构分析的主要目标蛋白质结构分析的主要目标 1. 1. 建立研究蛋白质结构建立研究蛋白质结构信息发掘与预测信息发掘与预测的的方法；方法；2. 2. 研究参与生命活动过程的蛋白质的研究参与生命活动过程的蛋白质的物

4、理物理性质、空间架构、功能片段和相互作用性质、空间架构、功能片段和相互作用；3. 3. 探索基于蛋白质结构表征蛋白质的探索基于蛋白质结构表征蛋白质的生物生物学意义学意义；4. 4. 得到得到新的预测性的知识新的预测性的知识。蛋白质的组织层次蛋白质的组织层次一级结构一级结构 二级结构二级结构 三级结构三级结构 四级结构四级结构蛋白质结构分类法蛋白质结构分类法Class (10) 结构类结构类 Folds ( 25% 30% 同源同源 Homology 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构20种氨基酸残基由肽键相连成的序列AGPFSCHEDSGPFCSFPGA?.蛋白质结构原理1、20种标准氨基酸种标

5、准氨基酸疏水性Ala Val Leu Ile Phe Pro Met带电：Arg Lys Asp Glu (His)极性：Ser Thr Cys Asn Gln His Tyr Trp特殊：Gly (Pro)2、多肽链状结构、多肽链状结构3、二硫键、二硫键CYS-S-H + H-S-CYS CYS-S-S-CYS蛋白质结构与功能Hemoglobin (血红蛋白) 运输氧气 蛋白质结构与功能Porin (孔蛋白) 穿透细胞膜的运输 蛋白质通过其特定的三维结构行使其生物学功能。蛋白质通过其特定的三维结构行使其生物学功能。蛋白质结构的测定：蛋白质结构的测定： X-射线晶体学射线晶体学NMR电镜电镜A

6、FM蛋白质通过其特定的三维结构行使其生物学功能蛋白质通过其特定的三维结构行使其生物学功能。诺贝尔奖与蛋白质结构分析诺贝尔奖与蛋白质结构分析 Y 1914年诺贝尔物理学奖，劳厄年诺贝尔物理学奖，劳厄(M.von Laue) 发现晶体中的发现晶体中的X射线衍射现象射线衍射现象Y 1915年诺贝尔物理学奖，布拉格父子年诺贝尔物理学奖，布拉格父子用用X射线对晶体结构的射线对晶体结构的研究研究 Y 1936年诺贝尔化学奖，德拜年诺贝尔化学奖，德拜(P.J.W.Debye)用射线衍射技术用射线衍射技术探明分子中原子的排列与结合形式探明分子中原子的排列与结合形式 Y 1944年诺贝尔物理学奖，拉比（年诺贝尔

7、物理学奖，拉比（I.I.Rabi） 发明核磁共振法发明核磁共振法 Y 1958年诺贝尔化学奖，桑格（年诺贝尔化学奖，桑格（F.Sanger） 分离和测定一分离和测定一种蛋白质种蛋白质-胰岛素的氨基酸结构胰岛素的氨基酸结构 Y 1962年诺贝尔化学奖，佩鲁茨年诺贝尔化学奖，佩鲁茨(M.F.Perutz)和肯德鲁和肯德鲁 (J.C.Kendrew) 用用 射线衍射技术测定肌红蛋白和血红射线衍射技术测定肌红蛋白和血红蛋白蛋白 的原子排列的原子排列 Y 1964年诺贝尔化学奖，霍奇金（年诺贝尔化学奖，霍奇金（D.C.Hodgkin）测定维测定维生素生素B12等复杂晶体的结构等复杂晶体的结构 Y 197

8、2年诺贝尔化学奖，安芬森年诺贝尔化学奖，安芬森 (C.B.Anfinsen) 、莫尔、莫尔 (S.Moore)和斯坦和斯坦 (W.H.Stein) 对核糖核酸酶的三维结构及对核糖核酸酶的三维结构及其其 124个氨基酸顺序的研究个氨基酸顺序的研究 Y 1982年诺贝尔化学奖，克卢格（年诺贝尔化学奖，克卢格（A.Klug）将射线衍将射线衍射技术与电子显微技术结合发明显微影象重组技术，射技术与电子显微技术结合发明显微影象重组技术，以及在结构分子生物学方面的研究以及在结构分子生物学方面的研究Y 1985年诺贝尔化学奖，豪普特曼年诺贝尔化学奖，豪普特曼 (H.A.Haupt-man) 和和卡尔卡尔(J.

9、Karlc) 开发了用于开发了用于X射线衍射确定物质晶体结构射线衍射确定物质晶体结构的直接计算法的直接计算法 Y 1991年诺贝尔化学奖，恩斯特年诺贝尔化学奖，恩斯特 （R.Ernst） 发明了傅发明了傅立叶变换核磁共振分光法和二维核磁共振技术立叶变换核磁共振分光法和二维核磁共振技术 Y 2002年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖，库尔特库尔特维特里希维特里希“发明了利用发明了利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法”（一）蛋白质晶体结构（一）蛋白质晶体结构X-衍射分析衍射分析 摸索蛋白质结晶条件、快速处理晶体结构数据和摸索蛋白质结晶条件、快速

10、处理晶体结构数据和减少差错是目前蛋白质晶体结构分析的两大难题减少差错是目前蛋白质晶体结构分析的两大难题或瓶颈。或瓶颈。是目前分辨率最高的结构测定方法，高通量晶体是目前分辨率最高的结构测定方法，高通量晶体结构分析中的几大重要环节是：数据处理与分析结构分析中的几大重要环节是：数据处理与分析、重原子的定位、密度修饰、分子替换、图形整、重原子的定位、密度修饰、分子替换、图形整合、模型加工和确认。合、模型加工和确认。晶体结构分析的常用软件有晶体结构分析的常用软件有SOLVESOLVE，RESOLVERESOLVE等。等。 （二）核磁共振波谱分析（二）核磁共振波谱分析 利用核磁共振原理，检测分子质量小于利

11、用核磁共振原理，检测分子质量小于60k60k的蛋白质，通过对其核磁共振谱线特征参的蛋白质，通过对其核磁共振谱线特征参数的测定来分析蛋白质的结构与性质，就是将原数的测定来分析蛋白质的结构与性质，就是将原始资料利用傅里叶变换转换为不同的峰值，然后始资料利用傅里叶变换转换为不同的峰值，然后采集各种不同的峰组成图谱，并利用生物信息学采集各种不同的峰组成图谱，并利用生物信息学方法筛选出具有特定结构特征的图谱。方法筛选出具有特定结构特征的图谱。 常用常用NMRPipeNMRPipe和和SPARKYSPARKY软件处理这些过程，使软件处理这些过程，使用用XEASYXEASY，DYANADYANA和和GARA

12、NTGARANT等软件分析侧链或骨架等软件分析侧链或骨架结构。结构。 与与X-X-衍射晶体分析技术相比较，衍射晶体分析技术相比较，NMRNMR技术在蛋白质技术在蛋白质结构测定的速度上、和研究的对象上都存在一定的结构测定的速度上、和研究的对象上都存在一定的限制，成本太高，步骤繁多。但其无需制备晶体标限制，成本太高，步骤繁多。但其无需制备晶体标本，可在溶液中直接测定，也可进行固相测定，因本，可在溶液中直接测定，也可进行固相测定，因此利用此利用NMRNMR法使得某些无法获得晶体结构的蛋白质法使得某些无法获得晶体结构的蛋白质或非液相蛋白质（如膜蛋白）的结构测定成为可能或非液相蛋白质（如膜蛋白）的结构测

13、定成为可能。相对而言，。相对而言，NMRNMR技术更适合小分子质量以及水溶技术更适合小分子质量以及水溶性较好培养晶体困难的蛋白质结构的分析，对于蛋性较好培养晶体困难的蛋白质结构的分析，对于蛋白质折叠、局部动力学或构象分析、蛋白白质折叠、局部动力学或构象分析、蛋白- -蛋白相蛋白相互作用，互作用，NMRNMR更体现其优越性。更体现其优越性。 X-X-衍射晶体分析技术和衍射晶体分析技术和NMRNMR技术的比较技术的比较（三）冷冻电子显微镜技术（三）冷冻电子显微镜技术 采用高压快速液氮冷冻方法使样品包埋在玻璃采用高压快速液氮冷冻方法使样品包埋在玻璃态的水环境中，使我们能够观察到生物大分子在天态的水环

14、境中，使我们能够观察到生物大分子在天然状态下的结构；同时冷冻的速度极快，把细胞在然状态下的结构；同时冷冻的速度极快，把细胞在其生理活动的某些特定时刻固定下来，显示此时的其生理活动的某些特定时刻固定下来，显示此时的结构特点，进而可通过不同功能状态的瞬时构象变结构特点，进而可通过不同功能状态的瞬时构象变化来研究生物分子的功能。冷冻电镜获得的是处于化来研究生物分子的功能。冷冻电镜获得的是处于天然状态下未经染色的分子的二维投影像。将样品天然状态下未经染色的分子的二维投影像。将样品进行不同角度的倾斜所获得的数据进行综合分析，进行不同角度的倾斜所获得的数据进行综合分析，并依据样品的不同特性使用不同的重构技

15、术获得分并依据样品的不同特性使用不同的重构技术获得分子的结构，在此基础上观察多种成分的图像变化，子的结构，在此基础上观察多种成分的图像变化，追踪生物大分子的装配及其动力学过程。追踪生物大分子的装配及其动力学过程。 由冷冻电镜技术所获得的蛋白质三维结构与由冷冻电镜技术所获得的蛋白质三维结构与X X射线射线晶体技术非常相似，而且其信噪比非常低，并适合晶体技术非常相似，而且其信噪比非常低，并适合于内在膜蛋白的分析。其独特优势为：可以用不同于内在膜蛋白的分析。其独特优势为：可以用不同的方法对均一的（如膜蛋白的二维晶体，二十面体的方法对均一的（如膜蛋白的二维晶体，二十面体对称的病毒等对称结构）和不均一的

16、（如核糖体等对称的病毒等对称结构）和不均一的（如核糖体等）样品进行三维结构重构，同时，冷冻电子显微镜）样品进行三维结构重构，同时，冷冻电子显微镜是唯一的能研究小到蛋白质、蛋白质复合物，大到是唯一的能研究小到蛋白质、蛋白质复合物，大到细胞器甚至整个细胞的方法细胞器甚至整个细胞的方法 。冷冻电子显微镜技术与冷冻电子显微镜技术与X X衍衍射晶体结构分析方法比较射晶体结构分析方法比较 以人类泪液载脂蛋白为例，具体介绍下其以人类泪液载脂蛋白为例，具体介绍下其在在PDBPDB数据库中结构检索和可视化过程数据库中结构检索和可视化过程 第一步：第一步： 输入关键字输入关键字“HUMAN HUMAN TEAR LIPOCALINTEAR LIPOCALIN” 第二步：第二步： 选择人类泪液载脂选择人类泪液载脂蛋白蛋白1XKI1XKI 第三步：第三步： 点击点击Biology AssemblyBiology Assembly面面板展示其结构图板展示其结构图 第四步：第四步： 1XKI1XKI结构展示图结构展示图 作业作业对如下给定序列进行搜索，找到其晶体结对如下给定序列进行搜索，找到其晶体结构，并下载该构，并下载该.pdb文件。作如下注释：文件。作如下注释：蛋白质名称，对应的基因名，单链氨基酸蛋白质