基因工程-基因工程载体

1、2021-7-7第三章 基因工程的载体n载体：携带外源基因进入受体细胞的工具n用于基因工程的载体用于基因工程的载体细菌质粒载体噬菌体衍生载体Cosmid载体Phagemid载体酵母质粒载体真核病毒载体Bacmid载体2021-7-7发展概况发展概况 1.1. 第一阶段（第一阶段（19771977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利用，天然质粒和重组质粒的利用，如如pSC101, colE1, pCR, pBR313pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar pBR322 (1977, Bolivar et alet al) ) 2.2.

2、 第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如隆位点区和新的遗传标记基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。 3.3.第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如同要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动子载体，表启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。达型载体及各种探针型载体。 2021-7-7第三章 基因工程的载体n作为基因工程载体的基本功能基本功能1. 运送外源基因高效转入受体细胞2. 为外

3、源基因提供复制能力或整合能力3. 为外源基因的扩增或表达提供条件2021-7-7第三章 基因工程的载体n作为基因工程载体必须具备的基本条件基本条件1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3. 长度尽可能小，以提高其载装能力4. 具有多种单一的酶切位点5. 具有合适的选择性标记2021-7-7遗传标记基因遗传标记基因 1. 1. 标记基因的作用标记基因的作用 1 1）指示外源）指示外源DNADNA分子（载体或重组分子）分子（载体或重组分子）是否进入宿主是否进入宿主细胞细胞 这种指示可以是选择性的（这种指示可以是选择性的（ApApr r ，

4、TcTcr r ，KanKanr r），也可以），也可以是非选择性的（如是非选择性的（如lacZlacZ） 2 2）指示外源指示外源DNADNA分子分子是否插入载体分子是否插入载体分子形成了重组子。形成了重组子。 * * 这种指示也可以是这种指示也可以是选择性选择性的（如的（如TcTcr r），也可以是），也可以是非选非选择性择性的（如的（如TcTcS S， lacZ, GUSlacZ, GUS），绝大多数为后者。），绝大多数为后者。 * * *有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前作

5、用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的多采用非选择性的检测性标记基因。有的基因是不能用作检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（选择性标记基因（lacZlacZ，GUSGUS等）。等）。2021-7-72.2. 标记基因的种类标记基因的种类 1 1）抗性标记基因抗性标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子） a.a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Ap: Apr r ，TcTcr r ，CmCmr r，KanKanr r，G418G418r r，HygHygr r ，NeoNeor r b. b. 重金属抗性基因重金属抗性基因: Cu: C

6、ur r ，ZnZnr r ，Cd Cd r r c. c. 代谢抗性基因代谢抗性基因: TK: TK，抗除草剂基因，抗除草剂基因 2 2）营养标记基因营养标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1TRP1，URA3URA3，LEU2LEU2，HIS4HIS4等。等。 3 3）生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ,

7、 GUS, lacZ, GUS, CATCAT 4 4） 噬菌斑噬菌斑 2021-7-7 3.3. 使用标记基因注意要点使用标记基因注意要点 1 1）标记基因与宿主细胞）标记基因与宿主细胞 2 2）标记基因产物的作用机制）标记基因产物的作用机制: Ap: Apr r 3 3）标记基因的结构与适用范围）标记基因的结构与适用范围: : 基因启动子基因启动子, , 翻译起翻译起始序列始序列, , 密码子偏爱性密码子偏爱性 4 4）标记基因的结构变化对功能的影响）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS: LacZ, GUS 4.4. 常用的遗传标记基因常用的遗传标记基因 1) 1) 四环

8、素抗性基因四环素抗性基因（TcTcr r） Tetracycline Tetracycline 可结合在核糖体可结合在核糖体30s30s亚基中的一种亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种编码一种399 AAs399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。素分子进入细菌细胞。2021-7-72) 2) 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（ApApr r） AmpicillinAmpicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。可抑制细菌细胞膜上参

9、与细胞壁合成酶类的活性。ApApr r抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化内酰胺内酰胺环的环的水解水解，使氨苄青霉素失活。，使氨苄青霉素失活。3) 3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（CmCmr r） ChlorophenicolChlorophenicol可结合在核糖体可结合在核糖体50 S50 S亚基上，阻止蛋白质合亚基上，阻止蛋白质合成。成。CmCmr r基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化乙酰化，导致乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。的氯霉素不能结合在核糖体上。4) 4) 卡那霉素

10、卡那霉素(Kan(Kanr r), ), 新霉素新霉素(Neo(Neor r) )和和G418G418抗性抗性(G418(G418r r) )基因基因 KanamycinKanamycin，NeomycinNeomycin和和G418G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5Tn5和和Tn903Tn903的的KanKanr r抗性基因均可使这类抗生素抗性基因均可使这类抗生素磷酸化磷酸化，使之不能进入细胞，使之不能进入细胞内。内。2021-7-7 5 5）半乳糖苷酶

11、基因（半乳糖苷酶基因（lacZ lacZ 和和lacZlacZ） 半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs1021 AAs，基因产物不具酶活，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链和链。前者负责四聚体装配，后者具链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作互补作用用。这两个部分可独立存在，。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为分别由两个基因编码。为链编链编码的基因称之为

12、码的基因称之为lacZlacZ( (编码编码145 AAs)145 AAs)。这两个基因（。这两个基因（LacZLacZ和和LacZLacZ）均可作为标记基因。）均可作为标记基因。 半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点: : a.a. 酶催化酶催化X-GalX-Gal水解为兰色产物，检测直观水解为兰色产物，检测直观 b. lacZb. lacZ编码编码5-5-端可容许很大的变化而不影响酶活性端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZc. lacZ和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大2021-7-7 P LacZ LacZ 转录转录 翻译翻译 Lac

13、ZLacZ基因的结构与产物基因的结构与产物pUC18 BamHI片段片段重组重组DNADNA分子分子 转化转化E.coliE.coli 外源外源DNA DNA BamBamHIHI片段片段 涂布在含涂布在含X-Gal和和Ap的平板上的平板上,白色菌落为重组白色菌落为重组子，子，兰色菌落兰色菌落为为原载体原载体利用利用LacZLacZ基因筛选重组子基因筛选重组子2021-7-7 6 6）葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUSGUS） 该基因编码一种可分解各种该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述解酶。该标记基因除具有上述lac

14、ZlacZ基因的优点外，它的适用范围十基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。分广泛，因为许多生物中没有这种基因。 7 7）荧光素酶基因荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入生荧光，若在反应中加入CoACoA，可使灵敏度提高，可使灵敏度提高1010倍；或由发光细倍；或由发光细菌（菌（Photobacterium fischeriPhotobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与）产生的荧光素酶，它与FMN-FMN-氧化氧化还原酶联用，通过还原酶联用

15、，通过NAD(P)HNAD(P)H的变化测定酶活的变化测定酶活。 8 8）发光蛋白质基因发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。大肠杆菌菌落呈蓝色。2021-7-7 分子克隆载体的复制起点与种类分子克隆载体的复制起点与种类 1. 1. 复制起点的种类复制起点的种类 1) 1) 核内复制起点核内复制起点 a. a. 染色体复制起点染色体复制起点原核生物原核生物( (环状环状) )和真核生物和真核生物( (线状线状) )染色体染色体 b. b. 染色体外复制起点染色体外复制起点 i. i. 质粒

16、质粒DNA,RNA,DNA,RNA,线状线状, ,环状环状, ,单链单链, ,双链双链 ii. ii. 病毒病毒同上同上, , 细胞内和病毒颗粒内细胞内和病毒颗粒内 2) 2) 核外复制起点核外复制起点 a. a. 线粒体线粒体所有真核细胞所有真核细胞 b. b. 叶绿体叶绿体所有绿色植物细胞所有绿色植物细胞 原核与真核生物原核与真核生物两种质体中亦可能含有质粒两种质体中亦可能含有质粒2021-7-7 3. 3. 按复制起点划分克隆载体按复制起点划分克隆载体 1) 1) 质粒复制型质粒复制型复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体 2) 2) ARSARS复制型复制型A

17、RSARS（autonomus replicative sequence)autonomus replicative sequence)，或，或称染色体复制型称染色体复制型 3) 3) 病毒复制型病毒复制型复制起点来自病毒，若为复制起点来自病毒，若为RNARNA病毒，必须反转病毒，必须反转录为录为cDNAcDNA。 4) 4) 混合复制型混合复制型 a.a. 同种生物复制起点混合同种生物复制起点混合质粒形式存在；质粒或病毒质粒形式存在；质粒或病毒形式存在形式存在2021-7-7 例：大肠杆菌（例：大肠杆菌（E.coliE.coli）的）的噬粒噬粒（phagemidphagemid）载体既含有来

18、自质粒）载体既含有来自质粒的复制起点，又含有来自噬菌体（如的复制起点，又含有来自噬菌体（如M13M13）的复制起点。在不）的复制起点。在不同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从而同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从而获得质粒获得质粒ds- DNAds- DNA或噬菌体或噬菌体ss ss DNADNA又如：酿酒酵母（又如：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）的某些载体既含有）的某些载体既含有质粒（质粒（22）复制起点，又含有）复制起点，又含有ARSARS片段片段 b.b. 不同生物复制起点混合不同生

19、物复制起点混合穿梭载体穿梭载体（shuttle vectorshuttle vector）两种两种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在生物中以质粒或病毒形式存在 * * 穿梭载体范围穿梭载体范围：细菌：细菌细菌（放线菌），细菌细菌（放线菌），细菌酵母菌，酵母菌， 细菌细菌真菌，细菌真菌，细菌动物动物2021-7-7Plac Plac LacZorioriF1(-)Ampr T 3 T 7 pBS-SK(-)pBS-KS(-)pBS(3.0 kb)pBSpBS载体的结构载体的结构2021

20、-7-7YRp12 (6.9 kb)oriTcrE EP B 大肠杆菌大肠杆菌- -酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体2021-7-7分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝数的关系数的关系 1. 1. 复制起点种类与拷贝数间的关系复制起点种类与拷贝数间的关系 1) 1) 质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，1-2 copies1-2 copies，受宿主染色，受宿主染色体基因控制）；高拷贝（松弛型，体基因控制）；高拷贝（松弛型，20 copies20 copies，受宿主染色体控，受宿主染色体控制较弱）制较弱） 2)

21、ARS 2) ARS型载体：拷贝数较高（约型载体：拷贝数较高（约20 copies20 copies） 3) 3) 病毒型复制起点：高拷贝病毒型复制起点：高拷贝 2.2. 标记基因与拷贝数的关系标记基因与拷贝数的关系 若标记基因表达效率高，宿主细胞可能不大量产生标记基若标记基因表达效率高，宿主细胞可能不大量产生标记基因以满足选择压力要求，因而载体拷贝数会降低。对于不同标记因以满足选择压力要求，因而载体拷贝数会降低。对于不同标记基因，可采取相应方法提高其拷贝数。基因，可采取相应方法提高其拷贝数。 如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。 对于营养标记基

22、因，可降低该基因的表达效率或更换其他低对于营养标记基因，可降低该基因的表达效率或更换其他低效率的标记基因效率的标记基因2021-7-7分子克隆载体的转化频率和稳定性分子克隆载体的转化频率和稳定性 1. 1. 影响转化频率的因素影响转化频率的因素 1) 1) 复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点 2) 2) 标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因 2.2. 影响稳定性的因素影响稳定性的因素 1)1) 复制起点类型复制起点类型低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性差差 2)2) 选择压力选择压力

23、 3)3) 载体在宿主细胞中的状态载体在宿主细胞中的状态自主复制型和整合型自主复制型和整合型 宿主细胞的遗传特性和生理特性宿主细胞的遗传特性和生理特性2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质1、定义 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n自主复制性自主复制性n质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立

24、于宿主细胞的染色体DNA而自主复制 2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n不相容性不相容性n利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争 ，几种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。 2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n可扩增性可扩增性npMB1或ColEI类质粒在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或Co

25、lEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增氯霉素扩增。 2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n携带遗传标记携带遗传标记 n在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞，但是即使在最佳条件下，受体细胞中也只有少数细胞能稳定地接受质粒，要想找到这些进入了质粒的受体细胞，就要利用载体质粒上的遗传标记，天然质粒上碰巧携带许多功能基因，它们便可被用作选择标记。 2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质3、分类 接合型和非接合型 严紧性和松弛型在基因工

26、程中使用的质粒都是松弛型质粒2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建1、理想质粒载体所具备的条件n质粒较小n质粒带有可供选择的标记n带有尽可能多的单一限制酶切位点n应有较高的基因表达能力2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建2、质粒人工构建的目的n 天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （3）缩短长度缩短长度，切去不必要

27、的片段，提高导入效率，增加装载量增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件加装特殊的基因元件方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。2021-7-7n多拷贝质粒多拷贝质粒 经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。 n 测序质粒测序质粒 拷贝数高，加装测定顺序所必需的序列，如多切口接头，便于各种片段方便克隆 n 整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上 n穿梭质粒穿梭质粒 含有两个不同的复制子，

28、能在两种不同的受体细胞中复制 n表达质粒表达质粒 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达 n探针质粒探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件，他通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等。 人工构建的质粒根据其功能及用途分为：2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建3、人工组建克隆载体-pBR322n大小：4.3 kbn选择标记：Apr Tcrn单一酶切位点：EcoR Hind BamH PstI Sal 等2021-7-72021-7-72021-7-7第一节 E.coli 质粒

29、载体二、质粒（plasmid）载体的构建3、人工组建克隆载体-pBR322n用于组建pBR322的三个亲本质粒的特征：npSE2124：Apr基因npMB8 :Col EI松弛型复制子npSC101:Tcr基因2021-7-72021-7-72021-7-7第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建4、人工组建克隆载体-pUC系列质粒n多拷贝大肠杆菌型质粒，包括pUC8/9 pUC18/19npUC的亲本质粒是pBR322,包括如下四个部分：n来自 pBR322 的复制起点（ori）n来自pBR322的Apr基因（核甘酸序列已发生改变）nE.coli的lacZ基因及其启

30、动子组成lacZ 基因nlacZ内部人工组装了一个多克隆位点（MCS）它含有如下单一酶切口：EcoRI、SstI、KpnI、SmaI、BamHI、XbalI、PstI、SphI、HindIII，。2021-7-72021-7-72021-7-7第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建4、人工组建克隆载体-pUC系列质粒npUC系列质粒的优点n更小的相对分子量和更高的拷贝数n可用组织化学法检测重组体n具有多克隆位点（MCS）区段是基因工程中目前最常用的是基因工程中目前最常用的E.coli克隆载体克隆载体2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体三、质粒（plasmi

31、d）的制备n碱裂解法 n（1）将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中 n（2）加溶菌酶裂解细菌细胞壁 n（3）加NaOH与SDS的混合溶液，去膜释放内含物 n（4）加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质 n（5）离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质及核酸酶 n（6）乙醇或异丙醇沉淀水相质粒 1.（7）无DNase的RNase处理残余RNA2021-7-7第一节 E.coli 质粒载体三、质粒（plasmid）的制备n沸水浴法 （1）将菌体悬浮在含有EDTA和Triton X-100的缓冲液中 （2）加溶菌酶破细胞壁 （3）放入沸水浴中煮40秒 （4）离心，

32、用无菌牙签挑去沉淀物 （5）乙醇异丙醇沉淀2021-7-7一、一、Ti质粒载体质粒载体 1. 根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与与Ti质粒质粒 G-菌，可侵入菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crown gall tumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征：冠瘿瘤细胞具有以下特征： i. 不需要补充植物激素便可进行离体培养不需要补充植物激素便可进行离体培养 ii.ii.合成肿瘤特有的化合物合成肿瘤特有的化合物冠瘿碱冠瘿碱(opine)(opine)，能专一，能专一 的为根癌农杆菌所利的为根癌农杆菌所利用用. .

33、这两个特征由这两个特征由TiTi质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。 三、其他质粒载体2021-7-71) Ti 质粒类型质粒类型（由（由Ti 质粒所产生的冠瘿碱种类而定）质粒所产生的冠瘿碱种类而定） i. 鱆鱼碱类鱆鱼碱类(octopine) ii. 胭脂碱类胭脂碱类(nopaline) iii.农碱类农碱类(agropine)2) Ti 质粒的结构质粒的结构 i. 环状环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区，具六个功能区 i) 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 ii) 冠瘿碱合成区：参与冠瘿

34、碱合成冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成 iii) 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解 iv) Ti 质粒转移区质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移：参与不同农杆菌中的接合转移 v) 毒（性）区：参与毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体的转移和插入植物染色体 vi) DNA复制区：参与复制区：参与Ti 质粒质粒DNA复制复制2021-7-7Ti 质粒 (160-250 kb)T-DNA Vir Rep tra tra分裂素Opine合成分解 25 bp重复区25 bp重复区Ti质粒的结构质粒的结构 2021-7-7 ii. T-DNA T-DNA包括植物

35、激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25 bp重复重复序列，序列，T-DNA整合不具特异性，右侧整合不具特异性，右侧25 bp重复序列对重复序列对T-DNA的的转移至关重要。转移至关重要。 不同不同Ti 质粒中的质粒中的T-DNA结构是不相同的，其中结构是不相同的，其中 i) 胭脂碱胭脂碱Ti 质粒的质粒的T-DNA长长23bp,结构连续，具结构连续，具13个基因个基因 ii) 鱆鱼碱鱆鱼碱Ti 质粒中的质粒中的T-DNA不连续，分左右两段，分别称之为不连续，分左右两段，分别称之为TL和和TR, TLDNA长长13.2 kb,含含8个基因，包括鱆鱼碱合成酶和

36、植物激素个基因，包括鱆鱼碱合成酶和植物激素合成基因合成基因, TR DNA长长7.9 kb，含，含5个基因，参与甘露碱个基因，参与甘露碱(mannopine)和农碱合成和农碱合成 iii) )两者同源性：主要集中在植物激素合成区。两者同源性：主要集中在植物激素合成区。 2021-7-75 7 iaaH iaaM ipt 6a 6b OCSNOSacs 鱼碱型T-DNA胭脂碱型T-DNATi质粒的质粒的T-DNA的同源性的同源性 2021-7-72. Ti质粒载体质粒载体 1) Ti质粒作为载体的问题质粒作为载体的问题 i) 太大，无适合克隆位点太大，无适合克隆位点 ii)T-DNA的存在不能使

37、转化细胞再生为完整植株的存在不能使转化细胞再生为完整植株 2) 载体类型载体类型 i)中间载体中间载体(intermediate vector) 由以下几部分组成：由以下几部分组成： 适合于适合于E.coliE.coli和和A.tumefaciensA.tumefaciens自主复制和选择用标记基因自主复制和选择用标记基因 适合于植物细胞选择用标记基因适合于植物细胞选择用标记基因 一段来自天然一段来自天然TiTi质粒的部分质粒的部分T-DNAT-DNA序列（提供同源重组）序列（提供同源重组） 1-21-2个来自个来自T-DNAT-DNA的的25bp25bp重复序列重复序列 用于表达外源基因的用

38、于表达外源基因的DNADNA序列（如启动子、终止子序列序列（如启动子、终止子序列）2021-7-7 中间载体或重组子中间载体或重组子 E.coli(中宿主中宿主) A.tumefaciens 在根癌农杆菌中与天然在根癌农杆菌中与天然Ti质粒或非致瘤质粒发生质粒或非致瘤质粒发生共整合作用共整合作用 感染植物受伤组织或与植物细胞共培养感染植物受伤组织或与植物细胞共培养 T-DNA进入植物细胞并整合到染色体进入植物细胞并整合到染色体DNA中中 外源基因表达外源基因表达转化转化接合接合转移转移 2021-7-7Ti A.tG-A.tA.tG-细菌间DNA的转移Ti A.tA.tA.t细菌-植物间DNA

39、的转移根癌农杆菌中根癌农杆菌中Ti质粒的转移质粒的转移 2021-7-7LIHtmsTiVirTiVirTiVirTiVirLIHTi-1Ti-3LIHTi-2Ti-2LIHTi-5Ti-6Ti-4vir分离两个25 bp重复序列,插入细菌载体分离25 bp和LIH序列,插入细菌载体除去致瘤基因除去致瘤基因和25bp序列Vir 用细菌载体DNA取代T-DNA除去全部T-DNATi-5是中间载体,Ti-6是双质粒载体Ti基因片段植物标记基因Ti质粒衍生的植物克隆载体质粒衍生的植物克隆载体 2021-7-7二、二、酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆载体的

40、分子克隆载体 1.克隆载体的种类克隆载体的种类 1) 按复制方式划分按复制方式划分 i. 自主复制型；自主复制型； ii. 整合型（非自主复制型）整合型（非自主复制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按复制子来源划分按复制子来源划分 i. 附加体型附加体型- yeast episomal plasmid(YEp)，其复制起点来自于酿，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒酒酵母的天然质粒-2质粒质粒 ii. 染色体复制型染色体复制型- Yeast Replicating plasmid(YRp)，其复制起点来，其复制起点来自染色体上的自主复制序列自染色体上的自主

41、复制序列(ARS-autonomous replicating sequence)三、其他质粒载体2021-7-7TELURA3 2AmprTcrURA3 YIpYEp YRpYLp pYAC AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcrTcrURA3OriOriOriOriCENYCp AmprTcrURA3OriTRP1HIS4TELTELTEL2URA3AmprTELARS酿酒酵母载体的种类和构建酿酒酵母载体的种类和构建 2021-7-7 * 若在若在YRp中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体YCp-Yeast Centrometric plas

42、mid * 若在若在YCp 或或YRp 中插入一段酵母的端粒结构，该质粒称之为中插入一段酵母的端粒结构，该质粒称之为YLp-Yeast Linear plasmid * 若将若将YLp质粒构建成环状分子质粒构建成环状分子,该质粒称之为该质粒称之为pYAC载体载体(Yeast Artificial Chromosome) 3) 标记基因标记基因 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如记，如ARG4ARG4，LEU2LEU2，TRP1TRP1，HIS3HIS3和和URA3URA3。使用这些遗传标记时，受使用这些遗传

43、标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在E.coliE.coli的转化体中来鉴别的。的转化体中来鉴别的。 2021-7-7 2. 酵母克隆载体的结构与特点酵母克隆载体的结构与特点 1) 穿梭载体，穿梭载体，YIp除外除外 2) 有适合两种生物的标记基因有适合两种生物的标记基因 3) 环状或线状环状或线状DNA 详见下表详见下表 2021-7-7载体类型载体类型 存在方式存在方式 所需所需DNA序列序

44、列 标记基因标记基因 转化频率转化频率 稳定性稳定性 （菌落（菌落/gDNA）无丝分裂）无丝分裂 有丝分裂有丝分裂 整合型整合型 整合整合 与染色体与染色体DNA Apr Tcr 10 +a +a (YIp5) 1-几个拷贝几个拷贝 同源同源 URA3 附加体型附加体型 自主复制自主复制 2质粒质粒 Apr Tcr 103-104 -b -c (YEp13) 多拷贝多拷贝 LEU2 复制型复制型 自主复制自主复制 ARS Apr Tcr 103-104 -b -c (YRp7) 多拷贝多拷贝 TRP1 着丝粒型着丝粒型 染色体状染色体状 ARS,CEN Apr 103-104 +d +d (Y

45、Cp19) 通常单拷贝通常单拷贝 TRP1,URA3 线型线型 染色体状染色体状 ARS，CEN TRP1，HIS3 103-104 +e + (YLp21) 通常单拷贝通常单拷贝 TEL a. 每次细胞分裂仍有约每次细胞分裂仍有约1%的载体的载体DNA从染色体上脱落下来从染色体上脱落下来b. 在选择培养基中在选择培养基中15-20代后，代后，10-30%的转化子丢失载体的转化子丢失载体DNAc. 非孟德尔式分离，主要是非孟德尔式分离，主要是4+：0-d. 无丝分裂时有无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离转化体质粒不发生分离在选

46、择培养基上丢失质粒的转化体低于在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1% 1% 酿酒酵母各种载体的特征酿酒酵母各种载体的特征2021-7-73. YEp载体载体 1) 酵母酵母2质粒质粒 i. 结构结构 ii. 结构特点结构特点 REP1 REP3REP2oriFLP P H HEREP1 REP3REP2oriFLP P H HEB formA form2774bp599bp51 bp51 bp16bp16bp16bp16bp11 bp11 bp13 bp 13 bp122 bp1072294002291782质粒的结构质粒的结构 2质粒倒置区的质粒倒置区的同向和反向重复片段同向和反向重复片段2

47、021-7-72021-7-72021-7-72）2质粒载体质粒载体 YIp中可插入整个或部分中可插入整个或部分2质粒质粒DNA构成构成YEp。大多数酿酒酵母菌株中都含有。大多数酿酒酵母菌株中都含有2质质粒，粒，YEp复制所需的酶可由复制所需的酶可由2质粒提供。质粒提供。 YEp具有具有YRp载体相同的特点，它还可以与载体相同的特点，它还可以与2质粒发生重组。重组质粒不稳定，在无质粒发生重组。重组质粒不稳定，在无选择压力条件下可很快消失。利用此特点可除去酵母菌株中的天然质粒，即选择压力条件下可很快消失。利用此特点可除去酵母菌株中的天然质粒，即Cir+ Ciro 当当YEp进入宿主细胞后，其转化

48、体内所含进入宿主细胞后，其转化体内所含DNA可得如下杂交图谱（设可得如下杂交图谱（设YEp为为8 kb，BamHI有一单切点）有一单切点）YEp13(10.7 kb)Tcrori22E EP B 1 2 3 410.710.710.76.33.53.51-YEp13 探针探针; 2-2质粒探针质粒探针; 3-LEU2探针探针; 4-pBR322探针探针2021-7-74. pYAC载体载体 酵母菌人工染色体酵母菌人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)广泛用于构建高等广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建动植物基因组文库的构建, 由由YLp经适当改造后构建

49、成经适当改造后构建成pYAC载体。载体。pYAC载体具有以下特点：载体具有以下特点： 1） 双双TEL位点；位点； 2） 三个酵母菌遗传标记基因；三个酵母菌遗传标记基因； 3） 一个一个SUP4基因用于检测重组子基因用于检测重组子，其原理是：，其原理是：SUP4是是tRNAtyr的赭色抑的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的制突变基因，但把该基因转入酵母菌的ade2赭色突变体时，宿主菌为白色赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在菌落，要是在SUP4基因中插入外源基因中插入外源DNA片段后在转化片段后在转化ade2宿主菌，转化子宿主菌，转化子成红色菌落。成红色菌落。2021-7-7YAC:酵

50、母人工染色体（yeast artificial chromosome）目前能容纳最大外源DNA片断的载体. nYAC载体有两个臂，每个臂的末端有一个端粒（TEL），臂上有着丝粒（CEN）、自主复制序列（ARS）、选择标记（TRP1和URA3）n装载容量：50Kb-2000KbnYAC载体是以质粒的形式出现，如：pYAC22021-7-72021-7-7AmprTELTELSup4CEN4 ARS1TRP1OripYAC4E Sm S X B X B pYAC OriTRP1TELTELHIS4AmprARSCENpYAC载体的结构载体的结构2021-7-72021-7-72021-7-7202

51、1-7-7第二节 噬菌体载体一、 噬菌体的分子生物学n噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和 DNA组成n1. -DNA的物理图谱n -DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端），称为cos区，全长48.5kb。 左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞，DNA自主复制以及调控基因，中间是负责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因2021-7-7A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 头部基因头部基因 尾部基因尾部基因

52、 功能不明区功能不明区 溶源化溶源化 重组重组 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 溶菌溶菌生长非必须区段生长非必须区段cI cI基因：溶源过程控制基因。基因：溶源过程控制基因。噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构2021-7-75-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 Cleavage Ligation(during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG-35-CG + GC-53-GCCCCGCCGCTGGAThe phage cos endsCircular form Linear

53、form 2021-7-72021-7-7第二节 噬菌体载体一、噬菌体的分子生物学2021-7-7 溶源阶段溶源阶段 ( (整合到寄主染色体上整合到寄主染色体上) )48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) phage2021-7-7第二节 噬菌体载体二、 噬菌体载体的构建n天然的DNA由于包装上下限的存在以及同种酶切口太多不适合作为重组实验的载体n1. 1. 缩短长度缩短长度 野生型DNA包装的上限为50.9kb，本身长度为48.5kb，那么外源DNA片段允许插入的大小至多为2.4kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒，

54、如果将缩短便提高装载量。其实DNA上约有40-50%的DNA片段（J-N区间）是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。2021-7-72021-7-72021-7-7第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建n缩短长度缩短长度 n插入型载体插入型载体 n 该类载体经改造后的长度为37kb，有单一酶切位点，便于外源DNA的插入。其允许插入片段最大为13.9kb。n根据插入失活效应的特异性分为两种亚型：n免疫功能失活插入型载体1.半乳糖苷酶失活插入型载体2021-7-7插入式载体：插入式载体： cI cI基因插入失活：基因插入失活：如如 gt10 gt10、NM1149NM1149等载体，在等

55、载体，在cI cI基因上有基因上有EcoR IEcoR I及及Hind IIIHind III的酶切位点。外源基因插入后将导致的酶切位点。外源基因插入后将导致cI cI基因的失活。基因的失活。cI cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。产生混浊的噬菌斑。 Lac ZLac Z基因插入失活：基因插入失活：如如charon16Acharon16A载体，在非必须区段引入载体，在非必须区段引入lac Zlac Z基因，在基因，在lac Zlac Z基因上有基因上有EcoR IEcoR I位点，插入失活后

56、利用位点，插入失活后利用X-galX-gal法筛选法筛选（兰白筛选）。（兰白筛选）。 2021-7-7 cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gt 10 lac ZLA 19.9RA21.9EcoR I Charon 16A2021-7-7第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建n缩短长度缩短长度 n替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体） 1.该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 2021-

57、7-7Lac 5 EcoR I EcoR IEcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Charon 4AEMBL3/4Charon 402021-7-7第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建n删除重复的酶切口删除重复的酶切口n插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是唯一的；n取代型载体在取代位点有两个酶切口，多了也不行2.天然的l-DNA上有许多重复的酶切口，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切口必须被删除。2021-7-72021-7-7第二节 噬菌体载体二、噬菌体载体的构建n构建琥珀型密码子突变体n 终止密码子有三种：UAA（

58、赭石）；UGA（乳白）；UAG（琥珀）n 琥珀型突变：CAG-UAG（stop）3. 将野生型-DNA上A和B两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG，当这种l-DNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的A和B头部蛋白，也就不能被包装，不能裂解细菌。阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。2021-7-72021-7-7第二节 噬菌体载体三、 -DNA作为载体的优点作为载体的优点n-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌n-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量n重组-DNA的筛选较为

59、方便1.4. 重组-DNA分子的提取比质粒容易2021-7-72021-7-7第三节 Cosmid载体一、Cosmid的定义的定义 nCosmid（cos sitecarrying plasmid）：是一是一类由人工构建的含有类由人工构建的含有 -DNA两端两端cos序列序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。n质粒复制子包括：一个复制起点和两个抗性基因Apr 、Tcr。2021-7-7Cosmid载体的特点载体的特点具有具有噬菌体的特性；噬菌体的特性；具有质粒载体的特性；具有质粒载体的特性；具有较高容量的克隆能力；具有较高容量的克隆能力；1.具有与同源性序列的质

60、粒进行重组的能力具有与同源性序列的质粒进行重组的能力2021-7-7第三节 Cosmid载体二、Cosmid的构建的构建 nCosmid含有-DNA两端cos区的质粒。由于-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，均1.5kb长。如果将这一小段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象-DNA一样，在体外被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌，与噬菌体DNA所不同的是，Cosmid不能在体内被包装，更不能裂解细胞不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进入细胞后，通过质粒上的复制子进行复制。2021-7-72021-