浅谈对实时荧光定量PCR技术的理解

1、1 / 10浅谈对实时荧光定量PCR技术的理解实时荧光定量 PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR是一种实时监控DNA扩增反应的技术。在PCF反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号积累进行实时监测整个PCR过程，并将DNA的累积速率绘制成动态变化图，在扩增的指数期对起始模板进行 定量，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。 该 项技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，促使PCR技 术从定性到定量的飞跃， 而且集特异性强、自动化程度高、灵敏度好、 污染少等优点为一体，现已在生物研究、医药、食

2、品等领域得到广泛 应用。1RT-qPCR勺基本原理和应用1.1基本原理RT-qPCR 的分类方法根据其化学原理可分为探针类和非探针类 两种，下面以TaqMar探针类和SYBR Green!非探针类两种常见方法 简述其原理。1.1.1TaqMar探 针法TaqMar探针是一种长度为20-24bp寡核苷酸探针，在其5末端 标记一个荧光报告基团(reporter),在3末端则标记一个荧光 淬灭基团。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入 TaqMar荧光探针， 其结合位点在两条引物之间 , 只与模板特异地结合。当完整的探针与 目标序列杂交时 , 荧光基团发射的荧光信号与 3端的淬灭剂接近而 被淬灭。但

3、在进行延伸反应时 , 聚合酶的 5外切酶活性将探针进行2 / 10酶切，将DNA探针逐个降解，使得荧光基团与淬灭剂分离。这样PCR体系3 / 10伸( 2)正比,可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。如下图1-1至图1-11激发光发C图1-2完整的探针，检测不到报告荧光图1-1切断的探针，检测到报告荧光 .图1-3变性荧光共振能量转移，FRET-3外切酶活性图1-8延伸（4）图1-9延伸（5）中荧光的强度与PCR产物量之间呈所示TaqMan探为针工作原理简图:能量图1-7延伸（3）图1-4退火图1-5延伸（1）报告基团和淬灭基团 分离而发光4 / 10图1-11延伸（7）作原理简图：1.1.3

4、两种方法的优缺点图1-12 SYBR染料处于游离状态图1-13 SYBR染料与双链 DNA分子结合产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但价格昂贵。后者可以与所有的双链 DNA,且价格相对较低，更简便易行。图1-10延伸（6）1.1.2SYBR Greenl 染料法SYBFGreen I荧光染料是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于DNA双链的小沟区域，其最大吸收波长约为 497nm发射波长最大约为520nm特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。因此，根据荧光信号检测

5、出PCR体系中存在的双链DNA数量。如图 1-12 和图 1-13 为 SYBRGreen I 工特别地，由于SYBR Green I与所有的双链DNAffi结合，因此由总而言之，探针类是利用与靶序列特异性结合的探针来指示扩增TTTT相结合,因此设计的程序通用性好5 / 10引物二聚体、单链二级结构及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定 量的精确性。可以通过测量升高温度后荧光的变化帮助降低非特异产 物的影响，由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBRGreen I 得到的定量结果。1.2RT-qPCF技术的主要应用1.2.1 医学领域RT- qPCR技术目前应用最为广泛的是医学领域， 包

6、括病原体的检测，例如病毒、细菌、病原体的定量监测及治疗药效评价；基因的 点突变及单核苷酸多态性（SNP分析；临床疾病的诊断，如各型肝 炎、艾滋病、禽流感、结核、性病诊断，肿瘤基因的检测和诊断等。1.2.2植物中的应用RT- qPCR技术是一种很好的检测基因表达的方法，通过RT-qPCF可以分析植物在不同处理条件下基因样本的表达差异，也可以 分析植物在不同生长发育时期基因表达的差异。 该项技术的应用对植 物病理学研究和植物遗传育种研究起到了推进作用。1.2.3食品安全应用RT- qPCR技术对食品中的微生物进行检测和研究，不仅可 以对活体微生物核酸量进行检测， 还可以对已死的生物进行检测。 该

7、项技术的应用也使得转基因食品的检测突破了从定性到定量的界限。1.2.4其他科学研究此外，RT- qPCR技术在其他分子生物学相关定量研究领域的应用也取得了较大进展，如：在动植物基因工程、微生物鉴定与分类、 6 / 10昆虫分类和鉴定中的应用及昆虫检疫等。2一般实验步骤在进行实时荧光定量PCF前，主要有RNA羊品抽提、RNA质量检 测、样品cDNA的合成，引物设计合成及其他药品购买，选择合适的 荧光定量方法等。在正式试验前需进行验证实验， 以确定扩增效率（一 般大于 1.9 为有效）、动力学范围，确保准确度、精密度。接着需要 做的有：梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（3 -actin ）实时

8、 定量PCR、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的 DNA模板、待测样品 的待测基因实时定量PCR、电泳检测PCF产物是否为单一特异性扩 增条带及数据分析。特别地，学院现有的7500型实时荧光定量PCF仪可同时实现特 异性靶基因检测与定量。7500型实时荧光定量PCF仪采用96孔反应 板或单个及8联管，反应体积25-100ul。该仪器将PCR热循环，荧 光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCF每一循环 各反应管中PCF扩增产物逐渐增加的情况。PCF实验结束后可以马上 得到定量结果，无需凝胶电泳分析和 PCR产物纯化。3常见问题分析3.1 如何甄别可疑的扩增根据电脑自动给出的标准曲线，确

9、定样品所含的目的 DNA初始 量时，标准曲线的相关性应该不小于 95%。同一样品的 3个平行反应 所得出的 Ct 值之间的差值不应大于 0. 5 。甄别可疑扩增还可以通过这三方面来判别， 看扩增曲线的形状，7 / 10正确的扩增一般有明显扩增阶段（特别是指数增长期） ，所有的曲线 有较好平行性。查看 Y 轴的数值，“可疑”曲线的指数增长期范围常 常是落在 1e-2 的范围内。看线性图，曲线没有明显的上升趋势则提 示不存在正确扩增。3.2 试验重复的问题 一般来说，为了减少加样以及实验系统的误差，每一次实验内 包含两个生物学重复， 即处理同样的东西两份， 也有两个相应的对照。 所以一般直接取平均

10、值，若出现一个数值偏差，则去除离群值，取剩 下的两个值平均。 若三个值分散都太大， 则说明实验操作可能存在问 题，需要重新实验。实验重复率低首先可以考虑是否加样出现问题，试剂混合均匀 问题、出现泊松分布，或者反应体系过大、液体超出反应孔平面，没 有使用ROX校准等。3.3 扩增曲线的斜率不一致 一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶 段，荧光信号指数扩增阶段，线性扩增阶段和平台期。只有在指数扩 增期，PCF产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，选择该 阶段进行定量分析。 但如果在此阶段扩增曲线的斜率出现不一致， 则 提示可能样本不好，即可能存在乙醇、蛋白酶等抑制物。可用分

11、光光 度计测量样品 260/280 比值，重新检测样品质量。另外，也可以考虑是否是因为加样不准确，标准品出现降解、引物设计不好等问题。3.4如何判断有无非特异性扩增 在染料法实时荧光定量时，可以根据溶解曲线进行分析是否存 在特异性扩增。如果出现单一峰且峰值在 Tm值位置出现，证明没有 8 / 10非特异性扩增，且初始模板没有被污染；如果出现多个峰，估计是有 非特异性扩增了或者初始模板被污染了。出现非特异性扩增，可能的原因有：样本污染、引物特异性不 好、形成了引物二聚体、镁离子浓度过高等，根据可能出现的原因进 行逐一排除分析，改变条件。因退火温度引起的非特异性扩增，可以 通过梯度PCR确定最佳退

12、火温度。另外，对于 GC含量较高的片段， 可以考虑加入适量二甲基亚砜（DMS）提高DNA片段的特异性。3.5荧光信号的读取荧光信号的读取（Plate Rea6是用来显示PCF产物的浓度的， 一方面来看，如果定量过程中发现PCR未出现扩增，不仅仅应该考虑 模板或实验操作的问题， 还需把产物进行电泳看看是否有条带， 以排 除染料或探针的问题而导致的未读取信号。另一方面，荧光信号的读取一般延伸步骤，但如果在该步读取 荧光值总是出现非特征峰， 可以考虑在后面加一步高温步骤 （约 80-85 度）读取荧光值。3.6荧光信号标准曲线的制作一般仪器很难做到 100 拷贝以下的准确定量，一般用来做标准 曲线的

13、最小浓度为 1000拷贝，以确保可靠性。3.7其他问题在实验中特别要注意实验的清洁，戴手套防止试剂污染。另外， 也要注意仪器使用的规范，严格按照操作流程使用。先开电脑，待电 脑完全启动后再开启定量PCF仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可 打开定量PCR的收集软件，进行实验。确认实验已经结束后，首先关 9 / 10闭信号收集软件，然后关掉定量PCF仪主机的电源，最后关闭电脑。参考文献1周晓丽,朱国坡,李雪华,王艳玲,刘兴友.实时荧光定量PCF技术原理与应用J.中国畜牧兽医，2010,02:87-89.2赵焕英,包金风.实时荧光定量PCF技术的原理及其应用研究进展J.中国组织化学与细胞化学杂志，2

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15、在植物病害中的应用J.中 国农学通报，2009,07:52-56.7王荣谈,刘冬儿，厉建萌,张大兵,杨立桃.实时荧光定量PCR技术 及其在植物转基因产品检测中的应用J.植物生理学通讯,2009,06:591-597.8马月萍,戴思兰,马艳蓉.荧光定量PCF技术在植物研究中的应用J. 生物技术通报,2011,07:37-45.10 / 109程海星，郭月英，任霆，张静，王乐，张利霞，靳烨.实时荧光定量PCF技术原理及在食品检测中的应用J.食品与发酵工业,2015,03:243-247.10吴永彬，肖维威，马文丽.实时荧光定量PCF技术在转基因食品检测领域中的应用J.生物技术通讯，2011,22(

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