调控抗酶蛋白程序性核糖体移码表达效率的抗结直肠癌机制研究

1、调控抗酶蛋白程序性核糖体移码表达效率的抗结直肠癌机制研究一、研究背景及目的世界范围内,结肠直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是 最常见的癌症类型之一和主要的死亡原因。 发病率分别位于是男性肿瘤的第三位 和女性肿瘤第二位 , 治疗晚期结直肠癌的主要方法一直是奥沙利铂或伊立替康联 合 5-氟尿嘧啶( 5-fluorouracil,5-FU )的化疗方法 , 然而 5-FU 杀伤肿瘤细胞的 代谢机制仍不清楚 , 目前细胞内多胺类物质代谢的异常是导致结直肠组织细 胞癌变的一个重要因素。研究发现, 肿瘤细胞内多胺水平明显高于正常细胞 , 持续高水平的多胺与细 胞增殖、凋亡下降、肿瘤侵袭

2、和转移相关基因的表达上调有关。同时 , 降低细胞 内多胺水平可以提高放疗效果 , 提高正常细胞抗氧化的耐受性。因此, 抑制多胺生物合成是一种非常有潜力的肿瘤治疗策略。细胞内存在一 个以多胺、鸟氨酸脱羧酶( ornithine decarboxylase,ODC )和鸟氨酸脱羧酶抗 酶蛋白(ornithine decarboxylase antizyme,OAZ)三者相互影响相互拮抗的环 形调控模式 , 其目的是使细胞内的多胺浓度维持在一个稳定的水平 , 从而保证细 胞正常的生长分化。足量的多胺同时也是肿瘤细胞快速生长的必要条件。蛋白质的翻译过程中 , 由某些信号决定核糖体在mRNA特定位点上的

3、读码框可以发生程序性移动一个或 者更多核苷酸。这一过程称为程序性核糖体移码。它在自体调节中具有非常重要的作用。很多因素参与了程序性核糖体移码，但其机制尚不十分清楚。OAZ的表达是 非常重要的一种程序性核糖体移码事件0AZ1由oazl基因编码,在其解码中,需要有+1程序性核糖体移码(programmed+1 ribosomal frameshifting,+1 PRF )的翻译移码过程。这也是 0AZ1合成的必需途径和其关键性调控点。OAZ乍为多胺生物合成中关键限速酶 ODC勺上游分子，可以负性调控细胞内 多胺含量。同时OAZ还广泛参与细胞不同通路的生物活动。因此，以OAZ程序性核糖体移码作为抗

4、肿瘤药物的靶位点进行抗肿瘤药物筛选, 为肿瘤的治疗提供了新的思路。药物筛选实验结果提示 :5- 氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU )可以上调OAZ程序性核糖体移码效率,减少多胺的合成, 从而抑制人结肠癌细胞HT-29的生长,而5-FU上调OAZ程序性核糖体移码效率的 机制以及其在其他再编码事件中是否扮演不同角色尚无报道 , 我们的实验将在蛋 白翻译水平从核糖体再编码角度探究 5-FU 作为经典化疗药物 , 在转录后翻译 mRN再编码过程中发挥的作用。二、研究方法、结果(一)构建双荧光素酶报告基因载体，筛选上调OAZ移码效率药物构建的双荧光素酶报告基因载体 , 并以其为工具对包括

5、巯基嘌呤、阿 糖胞苷、拉米夫定、 5-FU 及利巴韦林在内一系列药物进行筛选 , 依据荧光素酶活 性检测OAZ移码表达效率,发现即使在低于临床常规治疗浓度100倍的条件下 5-FU同样能显著上调OAZ的移码效率，而不其总mRN表达水平没有发生改变。 内源验证结果同样证实上调 OAZ移码效率的同时OAZ蛋白表达量显著提高,导致 下游ODC表达量及活性显著下降，而降低细胞内多胺水平，体外实验提示这种效 应能显著抑制结肠癌细胞HT-29生长。(二) 5-FU通过掺入成熟rRNA上调OAZ的移码效率为了进一步研究 5-FU上调OAZ移码效率的机制,我们通过培养基中参加32P-正磷酸盐来 标记rRNA,

6、分别用Uracil和5-FU处理细胞,提取总RNA变性琼脂糖凝胶电泳分离rRNA,并用核酸酶 P1消化为单个核苷酸，2D-thin layer chromatography(2D-TLC结果证实5-FU可以成功地掺入到成熟rRNA中。这种效应可以减少尿 嘧啶向假尿嘧啶核苷转化的比例。因此，我们提出5-FU上调OAZ程序性核糖体移码的机制可能是:5-FU掺入到 rRNA中并改变了其空间结构，影响了其与mRN和tRNA的相互作用。我们进一步 通过分析多聚核糖体和核糖体亚基的沉降图谱发现 5-FU 改变了核糖体的组装和 多聚核糖体的数量。以上结果提示5-FU可以通过多方面机制改变翻译的忠实性和速度，

7、从而提 高了 OAZ程序性核糖体移码的效率。(三)5-FU可影响多种RNA再编码的表达效 率再编码事件广泛存在于生物体内 , 扩大了蛋白表达谱。为了探索5-FU在RNAH编码过程可能发挥的其他效应,我们将人类免疫缺陷 病毒( Human Immunodeficiency virus,HIV )的 -1 程序性核糖体移码( programmed-1 ribosomal frameshifting,-1 PRF )移码元件插入到 Rluc 和Flue之间,通过双荧光素酶报告基因实验,显示与OAZ+移码相似,5-FU能显著增 强细胞-1移码表达效率(180.33%)。进一步研究5-FU对再编码效率的

8、影响,结 果提示 5-FU 明显降低细胞识别终止密码的能力。与对照组Uracil相比,5-FU处理后,细胞对UGA,UAG口 UAA终止密码的识别 能力分别下降了 124%,82%和45%而mRN转录量与对照组相似；以内部核糖 体进入位点( Internal Ribosome Entry Site,IRES )依赖性翻译为代表的细胞 内非帽依赖性蛋白翻译途径 , 参与了多种基因的恶性转化和一些重要病毒如 HIV和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV )等的翻译过程。为了探究 5-FU对IRES依赖性蛋白翻译的影响,我们将含有HCVRES元件序列插入到Rluc和FLuc之间,

9、 构建了 Rluc-IRES-Fluc 双荧光素酶载体。然后以5-FU处理细胞,发现HCVIRES起始蛋白翻译效率下降了 43.03%。然 而,5-FU对帽依赖性蛋白翻译无显著影响。进一步在病毒空斑实验中发现：无论低浓度1卩M和高浓度10卩M的5-FU均 能显著抑制抗人巨细胞病毒增殖和其感染人胚肺成纤维细胞宿主的能力。 以上结 果提示5-FU通过多种机制影响RNA再编码过程。三、结论通过以上实验 , 我们得出结论如下 ： 细胞内稳定的高浓度多胺是肿瘤 细胞快速生长的必要条件,而多胺、ODCffi OAZ三者的环形调控模式，是维持细胞 内多胺浓度的重要机制。通过上调抗酶蛋白程序性核糖体移码表达效率 ,可以抑 制ODC舌性，进而降低细胞内多胺水平，最终实现了抑制结直肠癌细胞的增生的 抗肿瘤效应。5-FU作为经典的化