大鼠脊髓损伤BBB评分中文版

1、1011WesternWestern blotblot试验操作步骤、蛋白样品制备用细胞刮刀将细胞刮下（不要将培养基倒掉），用吸管将其吸至离心管中用4C预冷的PBS 1ml冲洗培养瓶2次收集入上述离心管中lOOOrpm，离心 lOmin倒掉上清，沉淀用1ml PBS重悬，转入EP管中，再加1ml PBS冲洗离心管壁上残留的细 胞转入EP管中4C，4000rpm，离心 5min倒掉上清液（用抢把残余上清吸干净）配制裂解液，计算所需用量，每个 EP管中加入100ul裂解液（10mg组织/100ul）若有4管（4组），配制400ul裂解液：PMSF储备液浓度100mM，用RIPA稀释至1Mm.【单去污

2、剂裂解液（PMSF）: 1mol/L Tris - HCl （pH8.0） 2.5ml; NaCl 0.438gTritonX-100 0.5ml ;蒸馏水至50ml;混匀后4C保存】4C裂解30-45min，每5min振荡一次4C 14000g离心5min,取上清（移入1.5ml的EP管中）。蛋白定量（常用BCA法，参见蛋白定量试剂盒使用说明）每管蛋白一致，分装约20ul/管左右（加入5X）uffer并用RIPA稀释成1 X）将蛋白样100C，变性5min, -80C（ or -20C）保存。二、SDS-PAGESDS-PAGE 的配制:1试剂及配制:（1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N

3、,N-亚甲基双丙烯酰胺1g，去离子水至100ml，过滤， 避光，4C贮存。（2）1. 5mmol/L Tris溶液（PH8.8）:称取18.15gTris碱（分析纯）加适量的超纯水溶解，用浓盐 酸（分析纯）调pH值至8.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。（3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）:称取12.1gTris碱（分析纯）加适量的超纯水溶解，用浓盐酸份析纯）调pH值至6.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。（4）10%SDS: 1g SDS加入10ml去离子水，室温贮存。（5）10%过硫酸铵溶液：0.1g过硫酸铵加入1ml水，4C保存，现用现配。2.制胶程序：（小

4、分子量）（1）（2）(3)装板（小玻璃朝外）配制分离胶，加TEMED后，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，从一边开始，并为浓缩 胶留足够空间（梳齿长约1cm）。立即覆盖蒸馏水至顶部，天冷可放入烤箱 待分离胶聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表） 避免气泡出现。待聚合后（约20分钟），拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽的前后槽， 加入10-20ul样品（蛋白量20ug左右）。左侧第一孔加maker,样品不够可用15-20分钟,，插入样品梳,在加样孔中laod ing buffer。（6）TEMED （可购买成品）（7）5X电泳缓冲液（Tank buffer）:称取15.14g Tr

5、is碱（分析纯）,72.1g甘氨酸份析纯）,5g SDS分 析纯），加适量的超纯水溶解，pH值应该在8.3左右，加超纯水定容1000ml，室温储存。（8）分离胶、浓缩胶液配方：（两个用小烧杯，用完立即刷）总体积5ml2ml5ml浓度12%分离胶5%浓缩胶10%分离胶水(ml)1.61.41.930%丙烯酰胺（ml）2.00.331.71.5mmol/L Tris 溶液(pH8.8)(ml)1.3一1.31.0mmol/L Tris 溶液(pH6.8)(ml)一0.25一10%SDS(ml)(透明)0.050.020.0510%过硫酸铵溶液（ml）0.050.020.05TEMED（ml）（铺胶

6、前加）0.0020.0020.002电泳：接通电源，浓缩胶80伏约半小时，此后分离胶120/160伏继续1小时左右。三、转膜:1、转移缓冲液的配制：（先用先配）试剂用量甘氨酸14.413gTris 碱3.0285g无水甲醇40-200ml（蛋白量150以上加40）水至 10002、转膜程序:（1）剪4张滤纸，和一张PVDF膜，大小与凝胶相同（滤纸要比胶小，膜稍大以防转膜时发生短路）。在膜的一角做一记号（或剪角）。（2）将剪好的膜依次序浸入100%甲醇（10秒）-去离子水（5min）T转移缓冲液（大于10min）。1.5x TBS: (PH 7.5)用时稀释5倍2.3.（3）滤纸和海绵（纤维）垫

7、浸入转移缓冲液中（大于 10mi n）（4）剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。（5）安装转膜装置：从正极（红色）-负极（黑色）依次为：白色边盒-多孔垫片T（12张）滤纸-PVDF膜-凝胶-（12张）滤纸-多孔垫片-黑色边盒。扣上吊扣后插进转膜槽 中。转膜槽内加冰盒，防止电泳时过热。（6）接通电源：恒流电转移两个小时，电流一般是 100mA （视蛋白大小而定）。（7）电泳结束后，关闭电源，将膜取出。四、封闭及免疫反应（一）试剂的配制:试剂1000ml用量Tris-base6.05gNaCI43.83g去离子水至 1000ml1x TBST: 1x TBS+0.05%Twee n-20试剂

8、1000ml用量Twee n-200.5ml1x TBS1000mlBlocking buffer: 1x TBST+5% Dry Milk试剂100ml用量Dry Milk5 g1x TBST100ml（二）、免疫反应程序:1.取膜（平头镊子，玻璃平皿），放入10ml Blocking buffer （封闭缓冲液），室温轻摇2h，或4C过夜。2. 一抗孵育，用TBST配制，1:1000 （比例须看说明书，装入塑封袋中赶净气泡后用封口机封口），室温摇床上孵育1h后4C过夜。用TBST室温洗膜10minX 3次3.二抗孵育。用Tbst稀释，1:2000 （比例须看说明书，方法同上），室温轻摇45

9、min-2h。4.用 TBST 洗膜 10minX 3 次。(3)定影液：定影粉（按说明书配制）2显影程序(1)发光液工作液的配制：等体积混合适量 A液（200ul）和B液（200ul），视膜大小而定, 直接在保鲜膜上混合。显色反应：将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体（切勿接触膜的蛋白面），然后置于保鲜膜上，浸入并与发光液均匀充分地接触。压片检测：将膜固定于暗盒内（蛋白面朝胶片）。暗盒内放入胶片，压片曝光。（压片时间要摸索，15s-过夜）(4)显影：胶片放入显影液，观察显影情况。（时间视显影情况而定）(5)定影：胶片放入定影液，2-10mi n。流水冲洗，干燥保存六、ECL膜再生1试剂膜再生液

10、：(500ml) SDS: 10g ； Tris： 3.62g ( Tris 碱)；H2O: 400ml 调 PH 值 6.7;定容至500ml ;加250 pl 3巯基乙醇。2膜再生程序:(1)TBST 洗膜 10minX 3 次(2)(3)TBST 洗膜 10minX 3 次五、显影:1试剂超敏发光液（ECL） （A、B液等比混合）显影液：显影粉（按说明书配制）用时将膜浸在膜再生液中，60r水浴30 min （摇床）封闭液封闭BBB法脊髓损伤的行为学评分评估大鼠后肢运动功能的恢复情况。将动物放置于平台上，观察记录其后肢的行走及肢体 活动。评分分三部分第一部分为0 7分，评判动物后肢各关节活

11、动第二部分为 8 一 13分，评判 后肢的步态及协调功能第三部分为 14 一 21分，评判运动中爪的精细动作，三项满分为21分. 定义：将动物放入一开口盆中，轻敲盆壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干 运动及其协调情况。0 无可观察到的后肢运动11或2个后肢关节轻度活动，一般为髋关节/膝关节。234567891011121314151617181920211个后肢关节大幅运动和另一关节轻度活动2个后肢关节大幅运动 所有3个后肢关节轻度活动 2个后肢关节轻度运动和第3个关节大幅运动 2个后肢关节大幅运动，第3个关节轻度活动 所有3个后肢关节大幅运动 不负重摆动，或足底着地，但不负重仅

12、站立的时候足底负重或偶尔/频繁/持续以足背负重步行，无足底负重步行 偶见负重步行，但前、后肢不协调由频繁到持续负重步行，但无前、后肢协调 由频繁到持续负重步行，偶见前、后肢协调 由频繁到持续负重步行，频繁前、后肢协调 持续协调足底步行，优势爪在刚触地和抬起时旋转 频繁足底步行，持续前、后肢协调，偶尔足背侧步行 持续协调足底步态，当前肢向前时无或偶有伸趾，优势爪刚触地时平行 持续协调足底步态，频繁伸趾，优势爪触地时平行，抬起时旋转 持续协调足底步态，频繁伸趾，优势爪在触地及抬起时均平行 持续协调足底步态，持续伸趾，优势爪在触地及抬起时均平行 基本内容同18,尾在部分或全部观察期中下垂 基本内容同

13、18,尾持续上翘，但躯体不稳出师表两汉：诸葛亮先帝创业未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此诚危急存亡之秋也。然侍卫之臣不懈于内，忠 志之士忘身于外者，盖追先帝之殊遇，欲报之于陛下也。诚宜开张圣听，以光先帝遗德，恢弘志士之气, 不宜妄自菲薄，引喻失义，以塞忠谏之路也。宫中府中，俱为一体；陟罚臧否，不宜异同。若有作奸犯科及为忠善者，宜付有司论其刑赏，以昭陛F平明之理；不宜偏私，使内外异法也。侍中、侍郎郭攸之、费祎、董允等，此皆良实，志虑忠纯，是以先帝简拔以遗陛下：愚以为宫中之事, 事无大小，悉以咨之，然后施行，必能裨补阙漏，有所广益。将军向宠，性行淑均，晓畅军事，试用于昔日，先帝称之曰 能”是以众议举宠为督： 愚以为营中之事, 悉以咨之，必能使行阵和睦，优劣得所。亲贤臣，远小人，此先汉所以兴隆也；亲小人，远贤臣，此后汉所以倾颓也。先帝在时，每与臣论此 事，未尝不叹息痛恨于桓、灵也。侍中、尚书、长史、参军，此悉贞良死节之臣，愿陛下亲之、信之，则 汉室之隆，可计日而待也臣本布衣，躬耕于南阳，苟全性命于乱世，不求闻达于诸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顾臣于 草庐之中，咨臣以当世之事，由是感激，遂许先帝以驱驰。后值倾覆，受任于败军之际，奉命于危难之间, 尔来二十有一年矣。先帝知臣谨慎，故临崩寄臣以大事也。受