超好研究生分子生物学课件第九章基因和基因功能分析基本策略

1、目 录 高等教育出版社 1 南昌大学医学院 万福生 第九章 基因和基因功能分析的 基本策略 目 录 高等教育出版社 2 由于基因克隆技术可以扩增特定基因片段，使基因 分析可以在体外或用各种动物模型得以实现。当前被称 为医学研究的“活试管”的转基因动物和基因敲除动物 两种模型的建立，其前期工作都是要构建基因载体。可 见，基因克隆在基因研究中的重要性。 分析基因可在DNA，RNA和蛋白质三个层面上进行， 研究者应根据研究目的筛选适当的实验方法和制定研究 技术路线。 基因分析是一种策略性非常强的工作，能用于基因 分析的实验技术和方法很多，选择适当的实验方法和切 入点是基因分析首先要考虑的，即要有一个

2、周密的基因 分析的策略。 目 录 高等教育出版社 3 3 一、基因分析的基本策略 ?(一)利用DNA 定性定量分析研究基因 1. DNA 序列测定基因的一级结构变化 人类基因组包含着决定一个人生 ,老,病,死及 精神,行为等活动的全部遗传信息 .基因或基因 组变异是人类多种疾病的根本病因 ,揭示基因 或基因组的结构变化是推动医学向纵深发展的 关键.也是揭示生命起源与进化 ,细胞生长与分 化,疾病发生与发展的分子机制 . DNA 序列测定常用于鉴定基因或基因组的变异 . 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 4 4 核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理 化学裂解法化学裂解法 (Maxam

3、-Gillbert 法法) DNA 链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (sanger 法法) 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 5 5 A A、化学裂解法、化学裂解法( (Maxam-Gillbert法法) ) 基本原理基本原理 基于某些化学试剂可以使 DNA 链在1个或2个 碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应 强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同 分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同 的DNA 片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记 DNA 的5末端，经放 射自显影即可在X胶片上读出DNA 链的序列。 目 录 高等教育出版社 6 6 B、DNA 链末端

4、合成终止法 目目 录录 高等教育出版社高等教育出版社 7 7 目 录 目 录 高等教育出版社 8 8 C、DNA 自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现 DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四 种双脱氧核苷酸，然后进行 Sanger 测序反应，反 应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后， 通过四种激光激发不同大小 DNA片段上的荧光 分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集 荧光信号，并依此确定 DNA碱基的排列顺序。 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 9 DNA自动测序结果举例 目 录 目 录 高等教育出版社 10 ?2. 基因拷贝数变化的分析方法基因拷贝数变化的分

5、析方法 ?用Souther blot分析基因拷贝数 此法通常只能分析已知基因的拷贝数.其成功与否的关 键在于适当的DNA 酶切消化和基因探针的标记. ?采用PCR 技术分析基因拷贝数 一般说来,传统PCR 不合用于分析基因拷贝数变化,但 差异PCR 和实时PCR(real-time PCR)可以用于基因拷 贝数的分析。有时也可通过对PCR 产物含量的多少估计 基因拷贝数在不同个体之间的差异，一般常用actin 等管 家基因作内参照。 目 录 高等教育出版社 11 11 Southern blot 的基本过程 目 录 高等教育出版社 1212 Northern blot 的基本过程 目 录 高等

6、教育出版社 1313 Western blot 的基本原理 目 录 高等教育出版社 1414 三 种 印 迹 技 术 的 比 较 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 1515 实时实时PCRPCR技术原理技术原理 目 录 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 1616 ?用原位杂交技术确定基因在染色体上的分布用原位杂交技术确定基因在染色体上的分布 首次将原位杂交首次将原位杂交(in situ hybridization, ISH)技技 术用于基因定位是术用于基因定位是1977年年,用此法确定了人和和 珠蛋白基因分别在11 和和16号染色体上的位置号染色体上的位置. . 荧光原位杂交荧光原位杂

7、交(fluorescence in situ hybridization, FISH) 是用特殊荧光标记是用特殊荧光标记DNA探探 针针, ,可在细胞、染色体及组织切片上检测细胞可在细胞、染色体及组织切片上检测细胞 内是否存在特定的内是否存在特定的DNA或或RNA序列，其分辩率小 于于100kb。 目 录 高等教育出版社 17 (二)RNA 定性定量分析观察基因表达活性 1. Nothern blot分析基因转录水平 Nothern blot 是定性分析mRNA 水平的常 用方法，也可相对定量分析特定 RNA 。其基本程 序与Souther blot相似。 RNA 样品制备和电泳 分离成为关键

8、步骤，操作人员的实验技巧是实验 成功与否的重要因素之一。现都倾向用 RT-PCR 方法。 目 录 高等教育出版社 18 2. RT-PCR 分析基因转录水平 通过RNA的分析,一是可以确定基因表达的组 织分布;二是可以确定基因的表达时相 。前者是 用Nothern blot技术，对不同组织来源RNA进行 定性杂交检测，以确定特定基因的组织分布。后 者是分析同来源的组织细胞在不同培养时间中 RNA的表达特点。 目 录 高等教育出版社 19 3.RNA 酶保护实验 基因转录后的RNA剪接可以直接影响基因活性 , 使一个基因产生多条多肽链或蛋白质产物。 RNA 酶保护实验(RNase protect

9、ion assay, PRA)是一种 液相RNA杂交技术，主要是用 RNase A 和RNase T1专一性降解单链RNA，分析受保护的杂交双链 RNA，从而确定RNA是否剪接、剪接种类、剪接 位点及内含子的可能位置等 。 PRA的基本程序主 要包括待测RNA的分离、 RNA探针的制备、待测 RNA与RNA探针的液相杂交和RNA酶消化等。 目 录 高等教育出版社 20 ?4 DNA芯片(DNA chips)技术 DNA芯片是生物芯片(bio chip) 中的一种,又称 基因芯片、DNA阵列(DNA array) 、c DNA芯片 等。生物芯片是指通过微电子、微加工技术在芯 片表面形成的微型生物

10、化学分析系统，以实现对 细胞DNA、蛋白质及其它物质高效、敏感而又 快速的处理。 bio chip 又分为DNA芯片、蛋白质 芯片及其它芯片三类。 目 录 高等教育出版社 21 ? DNA芯片技术分析基因转录活性的原理与核酸 分子杂交方法是一样的，都是用已知核酸序列 与靶核酸序列杂交，定性定量分析基因表达情 况，但不同的是DNA芯片表面集成了大量的核 酸分子探针，能在同一时间内平行分析大量的 基因转录产物。 DNA芯片技术还可用于基因 组研究、基因诊断、法医鉴定及药物研究等。 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 2222 目 录 目 录 高等教育出版社 23 (三)蛋白质定性定量分析揭示基因

11、表达活性 1.Western blot 分析特定蛋白质 Western blot 是用于分析克隆基因表达产 物分析最特异的方法，也是首选方法。其基本 步骤包括：样品蛋白质的制备、 SDS-PAGE 分 离、蛋白质的转膜、特定抗体与膜上相应蛋白 杂交及检测分析标记信号。如目的基因表达活 性较低，一般需采用免疫沉淀技术对目的蛋白 进行浓缩，然后进行 Western blot 。 目 录 高等教育出版社 2424 Western blot 的基本原理 目 录 高等教育出版社 25 2.荧光激活细胞分拣分析特定蛋白质 荧光激活细胞分拣(fluorescence-activated cell sorti

12、ng, FACS)技术，又叫流式细胞术(flow cytometry) ，是近年发展 起来的一种快速定量分析细胞的新技术，用于细胞表面分子 表达的定量分析，即可用于活细胞表面特定基因表达产物的 定量分析。因此，该技术可用于基因表达活性的分析。如绿 色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因，使转染成 功的细胞在表达外源基因的同时表达GFP，利用GFP的绿色 荧光，可用流式细胞仪进行检测。 3.免疫组化对细胞内蛋白的定位和半定量分析 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 2626 二、基因功能分析的基本策略 随着人类基因组计划(HGP) 的完成，人们对未知基

13、因功能的预测和研究成为21世纪的热点之一，其主要任 务就是在基因组上找出每项个基因和基因产物及其的功 能。制定合适的分析策略是进行基因功能分析的重要步 骤。基因功能分析可以在DNA 、RNA 和蛋白质水平上采 用不同的技术和模型来进行，转基因小鼠和基因敲除小 鼠是当前研究基因功能最常用的动物模型。下面简要介 绍几种用于基因功能分析的常用技术方法。 ?(一) 采用转基因模型研究基因功能 ?(二)采用基因敲除动物模型研究基因功能 ?(三)采用转录后基因沉默或抑制研究基因功能 目 录 高等教育出版社 27 (一) 采用转基因模型研究基因功能 研究基因功能的转基因模型目前主要有 动物 模型和细胞模型两

14、种。转基因小鼠模型是应用最 多的转基因动物模型。 1.利用转基因动物研究基因在体内的功能 转基因动物(transgenic animal)是指用人工 方法(转基因技术)将外源基因导入或整合到基因组 上，培育出带有外源基因并能稳定表达的动物。其 中将外源基因导入或整合到基因组上的过程 称转基 因(transgene)。上述这种能够产生转基因动物的 方法称转基因技术(transgenic technology)。 目 录 高等教育出版社 28 第一次获得了转基因小鼠是 1982 年。 由美国科学家Brinster和Palmiter将大鼠生长激素基 因(GH)与小鼠的金属硫蛋白基因(MT)连在一起，

15、构成 MTrGH融合基因，然后用显微注射法注射到小鼠受精卵 中，再移植到假受孕的子宫中，待其发育生长。这次共产 了21只小鼠，其中7只带有GH基因，而6只的体形较原小 鼠大一倍左右，即称超级小鼠或巨型鼠。转基因小鼠模型 是医学领域中应用最广泛的动物模型。 导入外源基因的方法主要有显微注射法、胚胎干细胞 法及逆转录病毒法等。 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 2929 目 录 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 3030 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 3131 ?显微注射法的特点： 经此法注射的受精卵的成活率约有60%，由此发育所得 的小鼠中大约有10-40%带有外源基因，其中80

16、%的基因整 合发生在单细胞期，成为转基因动物。另外20%在细胞分 裂后发生整合，这部分动物并不是所有细胞中都带有外源 基因，这类动物称嵌合动物(chimeric animal). 外源基因整合的拷贝数从1-几百不等，一般是在染色体 单个位点整合，偶尔有在不同染色体不同位点整合。外源 基因可几个片段首尾相连插入整合位点。 此技术的优点：导入基因的速度快、操作简单、对DNA 大小无限制（可达200kb以上）。 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 3232 胚胎干细胞法导入基因的基本过程 目 录 高等教育出版社 3333 核转移技术的基本原理 目 录 高等教育出版社高等教育出版社 3434 ?转基

17、因动物的应用 我国的转基因研究虽起步较晚，但进展较快，已经成功 制备了转基因大鼠、小鼠、牛、羊、兔子、猪及鱼等。 转基因研究的应用主要有以下方面： 研究组织细胞基因的特异表达； 研究外源基因的新表型，发现基因新功能； 研究外源基因插入后的突变表型，发现新基因； 建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 培育动物新品种； 制备基因产品； 建立人工的疾病动物模型。 目 录 高等教育出版社 3535 2.利用细胞模型研究特定基因的功能 利用细胞模型研究特定基因的功能 ?在细胞水平上进行转基因，以建立基因转染细 胞模型，可在DNA 、RNA 及蛋白质水平上研 究特定转染基因的功能。 ?转染细胞是研究基因

18、功能的常用细胞模型。 ?利用转染细胞研究基因功能时，可在细胞水平 上进行，也可在动物体内进行，如将转染某一 抑癌基因的肿瘤细胞接种到小鼠体内。目前许 多基因工程的重组蛋白的功能研究都采用转染 细胞模型。 目 录 高等教育出版社 36 (二)采用基因敲除动物模型研究基因功能 研究基因功能最直接的方法就是在被研究的动物基因 组中剔除这个基因。 ?基因敲除(gene knockout)是指通过DNA 同源重组定向 地将外源基因插入宿主细胞染色体中，使某特定基因在细 胞或活体内失活的过程。它是目前在体内研究基因功能的 最好方法。 ?基因敲除动物(gene knockout animal)是指通过同源重 组定向地在活体内剔除特定基因的动物。 ?基因敲除小鼠是指在两条染色体上的等位基因都失去功能 的小鼠。 目 录 高等教育出版社 3737 (三)采用转录后基因沉默或抑制研究基因功能 1. 利用RNA 干扰技术研究基因功能 RNA干扰(RNA interference,RNAi) 是指由短双链 RNA诱导的同源mRNA 的降解过程。 RNA干扰过程主要分 两个阶段：一是siRNA的生成，二是siRNA与细胞内某些酶 或蛋白质形成RNA诱导