细胞应激 参考课件

1、广州医学院病理生理学教研室 董伟华 Cellular Stress 细胞应激 ?概述 ?细胞应激反应 ?常见细胞应激的类型及机制 ?细胞应激与疾病的关系 概 述 细胞应激 ?细胞处于不利环境和遇到有害刺激时 所产生的防御或适应性反应。 ?高度保守 ?在进化中形成；应激导致的选择性压 力也有益于物种的进化 应激原 ?物理因素：压力 ?化学物质、药物、毒物 ?生物：病毒、细菌等 ?细胞必须物质缺乏：低氧、蛋白质或各种 物质缺乏 ?内环境失衡：体内产生的活性氧、渗透压 改变等 细胞应激反应 (cellular stress) 细胞应激包括一系列高度有序的事件 1.启动细胞内信号转导通路 进而调节靶蛋

2、白的活性， 特别是促进转录因子如 AP-1、NF-B、p53、低 氧诱导因子表达（或提高其转录活性） 2.多种特异性和非特异性的对细胞具有保护作用的 应激蛋白质合成：保护细胞免受损伤或修复已有 的损伤 3.若细胞损伤严重而修复无望，则诱导 细胞调亡 以细胞的自杀行为保护整体的利益 一.应激激活的细胞内信号转导 通路和转录因子 1.包括JNK/SAPK、p38、ERK途径。激活的级 联反应类似：MAPKKKMAPKKMAPK 2.效应：激活转录因子 保护性蛋白质生成 增 强细胞对应激原的抵抗力、或介导细胞调亡的 信号转导 3.激活因素: JNK/SAPK：紫外线、DNA损伤 剂、活性氧、高渗状态

3、、促炎细胞因子； p38：高渗状态、 LPS、细胞因子等； ERK： 多种应激原 (一)丝裂原活化的蛋白激酶 (mitogen-activited protein kinase, MAPK） 1.磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)： 产生:二酰甘油(DAG) PKC，拮抗细胞调亡； 三磷酸肌醇(IP3) Ca 2+i增高（如：炎 症细胞被激活的重要标志） 2.磷脂酶A2 (PLA 2 )：炎症反应中发挥重要作用 激活因素：TNF、凝血酶、缓激肽 (二)激活多种磷脂酶 PLA2 与炎症和器官组织损害 ?PLA2 催化磷脂水解，促使前列腺素、白三烯等 炎症介质形成，在炎症过程中发挥重要作用 ?

4、与各种病症如急性胰腺炎、败血性休克、多种器 官损伤有关，血中的 PLA2活性可用于这些疾病的 诊断和预后 ?IL-1能以时间依赖和剂量依赖的方式诱导 PLA2 的表达和分泌 ?PLA2 基因表达机制：涉及一些转录因子激活状 态的修饰，包括核转录因子 (NF-B) 3.鞘磷脂酶(SMase)： 作用：降解鞘磷脂生成神经酰胺（CM, 重要的 第二信使）鞘磷脂 -神经酰胺通路； 分类： 中性SMase：分布于细胞膜上，与 ERK通路及促 进细胞增殖、炎症反应的发生有关； 酸性SMase：分布于溶酶体，与 SAPK通路和细 胞调亡密切相关； 1.诱导因素：紫外线、电离辐射、 DNA损伤剂 2.激活酶类

5、：DNA活化的蛋白激酶(DNA- activated protein kinase , DNA-PK)、毛细 血管扩张共济失调突变（ ATM）激酶 3.作用：活化多种转录因子： P53、c-Jun、c- Fos、c-myc等；使热休克蛋白 90(HSP90)磷 酸化 (三) DNA损伤激活的蛋白激酶 (四) 其他的信号转导通路 ?PI3K-蛋白激酶(PKB)：促进细胞生存、 抗凋亡作用 ?其他 二.应激引发的生物效应 ?热休克反应：应激原 热休克蛋白对细胞的非 特异性保护作用 1.应激原蛋白质变性变性蛋白与HSP70结合 热休克因子(heat shock factor , HSF)活化调 节热

6、休克基因HSP70表达。 其他HSP表达也增多，但以HSP70最多 2. HSP70的作用：参与新合成蛋白质的正确折 叠和运输；识别变性蛋白质并与之结合，促使 其重新形成天然构象或加速其降解 （一）产生非特异性防御反应 ?特异性防御反应：除产生 HSP之外，依据应激 原的不同产生不同的特异性蛋白，对细胞产生 特异性的保护作用。如： 1.缺氧性应激 2.基因毒应激 3.氧化应激 4. （二）产生特异性防御反应 （三）对细胞增殖的影响 1. 促进细胞增殖：通过 MAPK/ERK通路。 心肌负荷过重，机械牵拉刺激 心肌肥厚； 慢性炎症：炎症介质 细胞增殖 2. 抑制细胞增殖： 通过JNK/SAPK通

7、路和P38细胞周期阻滞、 增殖抑制； DNA损伤P53通路G1期或G2期阻滞，修 复损伤的DNA （四）诱导细胞调亡 ?抑制细胞增殖的通路均与调亡有关。如： ?SAPK通路 ?P38通路 ?神经酰胺信号转导通路 ?P53通路 内质网应激 内质网(endoplasmic reticulum，ER) ?内膜表面积占细胞所有膜结构的 50 %，体 积占细胞总体积的 10 %，参与重要的生理 功能的维持 ?内质网巨大的膜结构为细胞内活性物质的反 应提供了一个广阔的平台，在许多信号调控 中起到关键作用 ?基本生理功能：负责蛋白质的合成转运、信 号肽识别、糖基化修饰、钙离子的贮存和调 节、信号转导及细胞内

8、钙的再分布 ?内质网是细胞凋亡调节中的重要环节 内质网的功能内质网的功能 ?内质网在蛋白质转运和折叠中起重要作用 ?内质网腔是一个独特的环境 ?内质网中Ca2+浓度是细胞内最高的 ?内质网腔是一个氧化性环境：这对于二硫键的 形成和分泌蛋白以及细胞表面蛋白的正确折叠 至关重要 ?内质网中富含使蛋白质折叠稳定的介质 Ca2+依赖性分子伴侣如葡萄糖调节蛋白 78(GRP78)以及钙网蛋白等,使其在蛋白质转 运和折叠中发挥作用 ER stress ?内质网是细胞中加工蛋白质及贮存Ca2+的 主要细胞器，对应激原的刺激十分敏感 ?内质网是完成蛋白质四级结构折叠形成的部位， 在内质网内存在着多种相关的酶系

9、统 ?这些蛋白质中的大部分功能与 Ca2+浓度的动态 变化密切相关 ?内质网应激对于增强细胞对损伤的抵抗及 适应能力具有重要意义，对细胞存亡具有 重要影响 内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ER stress） ?各种应激原作用于细胞后，通过诱发内质网 腔中错误折叠和未折叠蛋白质的堆积以及 Ca2+平衡紊乱而激活未折叠蛋白反应 （unfolded protein response, UPR） 及 细胞凋亡信号通路等内质网反应，称为。 ?Conditions interfering with the function of ER are collectivel

10、y called ER stress. 引起ER应激的因素 ?细胞内氧化还原调节紊乱 ?葡萄糖耗竭：干扰蛋白质N末端的糖基化而导致内质网应激 ?Ca2+调节紊乱：由于GRP78、GRP94以及钙网蛋白的 Ca2+依赖性分子伴侣的性质，内质网内Ca2+调节紊乱将导 致蛋白质不能折叠 ?病毒感染：内质网应激导致细胞死亡是为了防止病毒扩散的 一种古老而有效的机制 ?蛋白酶体功能受损：内质网内本身存在一定数量的蛋白质错 误折叠被转运至胞浆在蛋白酶体中降解。蛋白酶体功能 受损蛋白质转运障碍ER应激(如：导致神经退行性变中 常见的包涵体疾病） ER应激的诱导途径 ?未折叠蛋白反应(unfold prote

11、in response， UPR): accumulation of unfolded protein aggregates ?内质网超负荷反应(ER overload response, EOR)：excessive protein traffic usually caused by viral infection ?固醇调节级联反应 ?前两者由于蛋白质加工紊乱引起，后者是由于在 ER表面合成的胆固醇损耗所致 未折叠蛋白反应 （unfolded protein response, UPR） ?蛋白质在内质网内的正确折叠需要许多分子伴侣 蛋白协助，包括Bip/GRP78(immunoglobu

12、lin binding protein78) 和GRP94(glucose regulated protein94) 、折叠酶类等 ?当内质网中未折叠或错误折叠的蛋白增多时，应 激信号通过内质网膜传递到细胞核中，继而引起 一系列特定的靶基因转录和蛋白质翻译水平下调， 以利于内质网蛋白折叠形成，使细胞继续存活， 这种反应就是未折叠蛋白反应 (UPR) 葡萄糖调节蛋白(glucose regulated proteins，GRPs） ?一种内质网分子伴侣，是细胞为适应内质网应激状态所产生 的一类应激蛋白，与热休克蛋白（heat shock proteins， HSPs）有高度的同源性 ?1977年

13、，Shiu等发现，在无葡萄糖介质中培养鸡胚成纤维 细胞的过程中，可诱导产生两种分子质量分别为78kD和 94kD的蛋白质，分别将其命名为GRP78和GRP94。 ?GRP94只存在于真核生物中，是内质网内数量最多的糖蛋白， 可结合未折叠的多肽链，阻止蛋白质聚集，协助蛋白质折叠、 伸展、组装和转运，抑制错误折叠蛋白质的分泌 ?GRP94可促进肿瘤细胞增殖、转移及耐药，在肿瘤的治疗及 预后方面具有重要的临床意义 Role of GRP (glucose regulated protein) :GRP78, GRP94 ?preventing protein aggregation (keeping

14、 the unfolded proteins in a folding-competent state) ?binding and keeping Ca2+ in the ER lumen UPR信号传导途径 ?哺乳动物中有三条途径涉及UPR信号传导 ?PERK-elF2磷酸化-ATF4路径 ?IRE1-XBP1路径 ?ATF6路径 ?Science 2006, 313: 1564-1566 ） ?相关信号转导蛋白： ?PERK：RNA激活蛋白激酶的内质网类似激酶 ?elF2：真核翻译因子 ?IRE1（inositol requiring enzyme1, 肌醇必需酶-1, 属丝苏氨 酸激酶）

15、 ?XBP1（X-box binding protein1，X盒结合蛋白1）：转录因子，促 进多种基因的表达 ?ATF6(avtiviting transcription factor：激活作用转录因子) ?PERK-elF2磷酸化-ATF4路径 ?IRE1-XBP1路径 ?ATF6路径 1. PERK-elF2磷酸化-ATF4路径 ?IRE1和PERK是内质网膜上的跨膜蛋白激酶 ?无应激情况，IRE1和PERK与GRP78/Bip形成稳 定的复合物 ?当蛋白错误折叠或未折叠蛋白增多时促使 GRP78/Bip与其解离 PERK二聚真核翻译因 子(eIF2)的磷酸化终止翻译或阻止新合成的 蛋白持

16、续进入内质网 ；上调应激相关信号 (如 ATF4) 2. IRE1-XBP1路径 ?IRE1具有核酸内切酶功能 ?Bip耗尽IRE1二聚磷酸化激活切割XBP1 premRNA生成XBP1结合ERSE (ER stress response element ，应激反应元件) 刺激内质网伴侣蛋白的基因转录 ATF6路径 ?ATF6：含有bZip转录因子结构域的 型跨膜蛋 白，在非内质网应激状态下 ATF6主要以酶原形 式(P90ATF6)存在于内质网 ?未折叠蛋白在内质网聚集增多 ATF6从ER进入 Golgi被S1P(site1 protease) 和S2P酶切成 p50bZip转录因子到细胞核

17、 激活XBPI转录增 加结合ERSEUPR gene表达内质网伴侣 蛋白合成 UPR效应 ?内质网伴侣蛋白基因转录的上调，内质 网伴侣蛋白合成 ?蛋白质翻译减少 ?非折叠蛋白由内质网移入胞浆，并在蛋 白酶体中降解 UPR的生物学意义 ?适应环境变化、重建ER的正常功能 ?适应性机制： ?转录水平的调节：通过诱导相关基因表达而提高 ER的蛋白质折叠能力 ?增强ER中蛋白降解，清除错误折叠的蛋白质 ?上述适应性机制失效后，通过激活NFB， ER开始进入警报信号途径 ER应激的两个环节 ?适应性改变：恢复稳态 ?诱导细胞凋亡 一. 适应性改变：恢复稳态 ?寡聚化的IRE1与TRAF2结合激活NF-B

18、激活 Ask1而激活c-Jun（AP-1）和p38 MAPK信号转导通 路宿主防御相关的基因表达 ?IRE1转录因子XBP-1产生诱导与恢复蛋白质折叠 和降解非折叠蛋白有关的基因表达 ?PERK自身激活eIF2磷酸化而失活抑制细胞 mRNA的翻译。而另外一些mRNA被翻译，如ATF4 （ ATF4诱导某些恢复ER稳态基因的表达） ?ATF6被酶解成50kD的活性片断(转录因子) 进入细 胞核，结合至UPR靶基因启动子区的内质网应激反应 元件（ER stress response element, ERSE）导 致内质网应激蛋白表达增多 内质网应激蛋白 ?具有促进错误折叠及未折叠蛋白质的正确折叠

19、、 恢复内质网Ca2+转运、清除活性氧等功能 ?有助于增强细胞对损伤的抵抗力，促进细胞存活 ?类型：内质网分子伴侣（如 GRP78、GRP94、 ERp29、ERp72等）、蛋白二硫键异构酶 （protein disulfide isomerase, PDI ）、血 红素加氧酶-1、内质网Ca2+-ATP酶等 二. ER应激诱导细胞凋亡 当蛋白的错误折叠反应程度过强或持 续时间过长，ER应激将导致以细胞凋亡 为特征的细胞死亡 （一）ER应激诱导细胞凋亡的相关因素 1.蛋白酶:caspase-12与ER相结合。Caspase-12 是ER应激介导细胞凋亡的主要因素之一 ?ER应激激活caspas

20、e-12机制： 通过IRE1激活caspase-12：活化的IRE1水解 caspase-12前体而激活caspase-12 通过Ca2+依赖性蛋白酶（calpain）激活caspase-12: 在ER应激时，细胞内Ca2+水平升高引起胞质中Ca2+依 赖性蛋白酶的活化并转位于ER膜，剪切定位于ER膜上 的caspase-12前体，使之活化并释放入细胞质 Caspase-7可能通过移位至ER激活caspase-12 2.CHOP：ER应激可以诱导其高表达 ?CHOP基因启动子中包含所有 UPR诱导蛋白（如 ATF4、ATF6和XBP-1）的结合位点，并且这些 转录因子与CHOP基因的诱导表达具

21、有因果关系 ?过表达CHOP通过抑制Bcl-2而诱导细胞凋亡 （一）ER应激诱导细胞凋亡的相关因素 ER 应激的效应 常见细胞应激的类型及机制 一、基因毒应激 (genotoxic stress) （一）DNA损伤的原因和类型 1. 紫外线照射：DNA形成嘧啶二聚体，不能与 嘌呤配对DNA损伤 2. 电离辐射：产生活性氧和自由基 DNA碱基 损伤、双链和单链断裂 3. 化学诱变剂：烷化剂 DNA烷基化修饰基 因突变；碱基类似物 替代正常碱基，干扰 DNA合成 4. 病毒感染：RNA病毒、DNA病毒 1. DNA活化的蛋白激酶(DNA-PK)：位于细胞核内 的丝/苏氨酸蛋白激酶 作用：主要识别D

22、NA双链断裂 调节亚基识别DNA损伤并结合到双链 DNA断裂的末端与催化亚基结合并激活其活 性磷酸化转录因子P53、c-Jun和c-Fos效 应 2. ATM激酶：监控DNA损伤的激酶。在细胞周期检 查点的作用位于P53蛋白的上游 （二）DNA损伤激活的信号转导通路 和靶蛋白 3. 聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶 (poly ADP-ribose polymerase, PARP)：DNA损伤感应及检测分 子。功能与DNA-PK相似，但对DNA单、双链断 裂均能识别。 DNA损伤上述通路p53激活P53蛋白增多、活 性增强P21/WAF1、GADD45(生长抑制和 DNA损伤45基因产物)等靶蛋白转

23、录增加前者 负调控细胞周期、后者抑制细胞进入 S期细胞 周期G1期阻滞，进行损伤DNA的修复；或启动 调亡 （二）DNA损伤激活的信号转导通 路和靶蛋白 4. DNA损伤激活的其他信号转导通路： MAPK家 族的蛋白激酶激活： ERK、SAPK/JNK、 P38激活NF-B、AP-1、c-myc等 NF-B：紫外线和电离辐射活化的主要转录因 子。静止细胞中NF-B位于细胞质。基因毒制 剂刺激细胞NF-B活化，进入细胞核与B 增强子及启动子相互作用 促进基因表达 AP-1：c-fos、c-Jun的转录活性增高，二者产 物的二聚体为AP-1 （二）DNA损伤激活的信号转导通 路和靶蛋白 AP-1

24、(activator protein 1, 激活子蛋白-1) ?由c-jun蛋白和c-fos蛋白家族成员之间相互作用而形成多 种形式的同源二聚体或异源二聚体AP-1 ?细胞内一种重要的转录因子, 被誉为细胞内信号传导的第三 信使, 在细胞增殖，分化，凋亡，胚胎发育，炎症及其它 病理过程中起着重要作用 ?诱导因素：激素、生长因子、细胞因子、神经介质、热休 克、电休克、紫外线、氧应激、以及过表达的癌基因等 ?活化的AP-1启动基因转录的分子开关, 调控IL-1、TNF- 、 IL-6、IL-8、 MIP-1、MCP-1、 ICAM- 1、 VCAM-1和 Pascel等基因的表达 1. 细胞周期阻

25、滞、DNA修复 G1期阻滞：check point；P53 G2期阻滞：DNA损伤Cdc2激活受抑G2检查 点阻滞细胞不能进入M期（G2期阻滞也必须 有P53的参与） DNA修复：P53吸引和活化DNA损伤修复蛋白， 促进DNA修复 2. 细胞调亡 P53诱导的调亡： P53非依赖的调亡：SAPK/JNK通路、TNF （三）DNA损伤引发的细胞反应 二、缺氧性应激 (hypoxia cellular stress) （一）缺氧的识别及信号转导通路 ?缺氧的识别：氧感受器。位于细胞表面， 辅酶氧化酶(NADPH氧化酶)是最可能 的氧感受器 ?低氧的信号转导：Ca2+、NO、CO都在 信号转导过程

26、中发挥作用 1.HIF1的结构：由2个亚基、组成异二聚体 2.HIF1的诱导：低氧时，HIF1合成增加、降解减少， 而HIF1不受低氧诱导。 3.生物效应及作用机制：HIF1的靶基因有： 促红细胞生成素(EPO)基因：导致红细胞增多 VEGF基因：促进血管形成,改善缺氧血管新生 葡萄糖转运子-1和糖酵解酶基因：增强糖酵解 血红素加氧酶(HO-1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因： NO产生增多，舒张血管，增加血流量和血管通透性，增加 组织供氧 （二）缺氧诱导因子HIF1及其生物学效应 ?The key molecule in oxygen sensing is the transcript

27、ion factor hypoxia induced factor-1 alpha (缺氧诱导因子，HIF-1a). ?Under normoxic conditions HIF-1a is constantly produced and constantly ubiquitinated ?This ubiquitination is mediated by a protein called Von Hippel-Lindau protein (pVHL). ? pVHL can only do this when a particular proline(脯氨酸) residue in HI

28、F-1a is hydroxylated(羟基化) ?This hydroxylation is carried out by a particular prolyl hydroxylase(脯氨酸羟 化酶) which is only active under normoxic conditions ?When the oxygen concentration drops this enzyme is no longer efficientthe proline residue in HIF-1a doesnt get hydroxylatedpVHL can no longer mediate ubiquitination of HIF-1a HIF-1a accumulates in the cell and activates gene expression 三、氧化应激 (oxidative stress, OS) 氧化应激 ?氧化应激(oxidative stress，OS ) 是指机体活性氧产生过多或 /和机体 抗氧化能力降低，前氧化系统和抗氧 化系统平衡紊乱，从而导致潜在性损 伤的病理过程。 活性氧 ?中性粒细胞、巨噬细胞 ?线粒体 ?嘌呤分解代谢 ?