DNA的电泳检测

1、DNA的琼脂糖凝胶检测的琼脂糖凝胶检测 在分光光度计检测的基础上，进一步用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的纯度与浓度，重点检测DNA是否降解，是否含RNA与蛋白质。实验目的了解琼脂糖电泳法检测DNA质量与浓度的原理掌握琼脂糖电泳法检测DNA质量与浓度的方法学会分辨不同质量DNA的电泳带型实验原理 电泳是现在用于分离和纯化DNA片段的最常用技术。制备好一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质，并把它置于静电场中，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会出现不

2、同的迁移率。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。 琼脂糖浓度 凝胶中的琼脂糖含量%（W/V）DNA/RNA分子的分离范围（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.232.00.12用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片段。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。 EB染料电泳缓冲液的组成 常用的电泳缓冲液的

3、配制缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris乙酸（TAE）1：0.04moL/L Tris乙酸 0.001moL/L EDTA 50：242g Tris碱57.7mL 冰乙酸100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0)Tris磷酸（TPE）1：0.09moL/L Tris磷酸 0.002moL/L EDTA10：108g Tris碱15.5mL 85%磷酸40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)Tris硼酸（TBE）0.50.045moL/L Tris硼酸 0.001moL/L EDTA5：54g Tris碱27.5g硼酸20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)加样缓

4、冲液缓冲液类型 6缓冲液贮存温度I 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液4II 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液室温III 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液4IV 0.25%溴酚蓝 40%（W/V蔗糖水溶液）4 V（碱性加样缓冲液） 300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液 015%溴甲酚绿 025%二甲苯青FF4增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内。使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。溴酚蓝移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍, 溴酚蓝移动的速率约与长300bp

5、双链线性DNA相同,而二甲苯青FF的速率则与4kb双链线性DNA相同。 DNA片段长度标记 DNA片段长度标记通常叫作 DNA Marker,本实验使用Bio DL2000 为DNA片段长度标记，分别由100bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000 bp、DNA Marker不仅可以作为凝胶中DNA片段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。每次取5ul电泳时，每条带的DNA量为50ng，750bp为100ng。所需仪器、耗材 电泳仪、电泳槽微量移液器凝胶成像系统天平各种玻璃器皿（烧杯、容量瓶及广口瓶）所需试剂 溴化乙锭（EB）琼脂糖TBE缓冲液加样缓冲液实验方法

6、视频 实验方法 1.配制琼脂糖凝胶称取0.2g琼脂糖,放入250ml锥形瓶中，加入0.5TBE缓冲液20 ml,于微波炉中溶解，定容至20ml。冷却至60左右，加入1ul goldview，混匀。将凝胶床水平放置，插入两端的挡板，用滴管吸取少量的凝胶封好胶床边缘。放入梳子，使梳齿高于底板0.5-1mm。倒入琼脂糖凝胶溶液，其厚度为3-5mm，放置待冷却，胶硬化。去掉两端的挡板，小心拨出梳子，检查样品孔是否完整。2.加样取一PCR小管，加入5ul DNA样品，再加入3ul电泳上样缓冲液，混匀后加样于凝胶的孔格内。操作时，可用右手持移液器，左手握住右手腕，左肘支撑桌面，防止点样时右手晃动。同样操作在第一样品孔内加入5ul DNA分子质量标准物。3.电泳电泳槽中加入电泳缓冲液，将胶床放入，液面高出胶面1-2mm。盖上电泳槽盖，接通电源，样品端接负极（DNA向阳极移动），以5V/cm电压电泳。使DNA移入琼脂糖胶内，一般为溴酚蓝迁移2cm左右。4.观察取出凝胶，置短波紫外线（254nm）下观察照像。比较样品DNA与DNA标准品的荧光强度，并计算出样品中DNA浓度。观察有无RNA、蛋白质及DNA降解条带。标准DNA样品结果分析结果分析DNA样品中有RNA污染DNA样品中有蛋白质DNA有降解，从总DNA开始拖尾注意事项防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接