流式细胞术原理及应用(新)

1、流式细胞术的原理流式细胞术的原理 及其应用及其应用 马洪星马洪星 FLOW CYTOMETRY 流式细胞术流式细胞术 FLOW CYTOMETOR 流式细胞仪流式细胞仪 Flow Cytometry Measuring properties of cells in flow Flow Sorting Sorting (separating) cells based on properties measured in flow Also called Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) 分为三大类： 第一类台式机 光路调节系统固定，自动化程度高，

2、操作简便，易学易掌握光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合适合 用于临床用于临床 第二类大型机 科研型，分辨率高，可分选用于培养，可选配多种激光器，更灵活科研型，分辨率高，可分选用于培养，可选配多种激光器，更灵活 第三类新型流式细胞仪 装配有装配有24根激光管，同时检测根激光管，同时检测15个参数，高速分选达个参数，高速分选达50000个个/s 流式细胞仪的主要组成部分： 流式细胞术是20世纪70年代发展起 来的一种技术，有人将流式细胞仪比流式细胞仪比 喻成高级的荧光显微镜喻成高级的荧光显微镜。 目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、

3、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。 流式细胞仪流式细胞仪荧光显微镜荧光显微镜 控制控制电脑电脑人脑人脑 光源光源激光激光紫外光紫外光 标本标本制备成的制备成的单细胞单细胞 （或颗粒）（或颗粒）悬液悬液 放于固定的标本放于固定的标本 台上台上 效率效率高高 几百几百几万个几万个 细胞细胞/秒秒 低低 几十个细胞几十个细胞/分分 结果结果精确、客观精确、客观有主观因素有主观因素 功能功能可同时测多个参可同时测多个参 数、能进行分选数、能进行分选 一般只测一个参一般只测一个参 数、不能分选数、不能分选 鞘液系统鞘液系统 流动室流动室 光路系统 检测区 光学原理光学原理 laser 抗体

4、标记的方法抗体标记的方法 抗体的选择抗体的选择 首选直接标记抗体首选直接标记抗体 荧光分子荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原最便宜，适用于强表达抗原 间接标记间接标记 适用范围广适用范围广, biotin-avidin不适合不适合 弱抗原的检测弱抗原的检测 数据处理系统数据处理系统 流式细胞分析的信息流式细胞分析的信息 Forward scatter(FSC) Side scatter(SSC) FL1-FITC FL2-PE FL3-PerCP PL4-APC 流式细胞的基本信息流式细胞的基本信息: “形态形态” 流式细胞的主要信息流

5、式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4 最常用的标记方法是荧光素分子标最常用的标记方法是荧光素分子标 记的抗体与细胞抗原结合记的抗体与细胞抗原结合 Gating 常用术语常用术语 流式常见图形流式常见图形 (Histogram Plot) 直方图适用于：单参数分析直方图适用于：单参数分析 流式常见图形流式常见图形 (Dot Plot) 散点图适用于：多参数分析散点图适用于：多参数分析 流式应用常见范围流式应用常见范围 细胞大小细胞大小 细胞的颗粒度细胞的颗粒度 细胞表面分子：细胞表面分子：CD 系列系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞浆内分子：胞内细胞因子

6、细胞核内分子：细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡细胞功能检测：细胞周期、凋亡 其他（膜电位、钙离子浓度、核酸等）其他（膜电位、钙离子浓度、核酸等） 实验对照的设计实验对照的设计 空白对照：空白对照：ALL 阴性对照：阴性对照：常用同型抗体对照常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照多色分析：同型对照，单阳性对照 （用于仪器校正）（用于仪器校正） 阳性对照：阳性对照：检测阴性时检测阴性时 实验标本的处理实验标本的处理 单细胞悬液的制备：单细胞悬液的制备： 物理法物理法（剪碎法、（剪碎法、 网搓法、研磨粉）网搓法、研磨粉）

7、化学法化学法（酶消化）（酶消化） 抗体或标记分子的染色：抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应抗原抗体反应 非特异结合的去除：非特异结合的去除：洗涤和封闭洗涤和封闭 封闭封闭血清和同型抗体血清和同型抗体 可用流式细胞仪分析的标本 外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、 石蜡切片、各种体液（尿、脑脊液、胸 腹水等） 单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非 细胞粒子、可溶性分子细胞粒子、可溶性分子 待测标本待测标本 处理成单event悬液 荧光素标记的单抗染色 鞘液 经处理的细胞单个通过激光聚焦区 检测散射光、荧光 信号转化、放大 计算机数据处理 分选 SORTING（

8、细胞分选）细胞分选） 分选速度分选速度 分选纯度分选纯度 分选收获率分选收获率 流式细胞术的应用流式细胞术的应用 细胞死亡分两种：凋亡和坏死细胞死亡分两种：凋亡和坏死 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控 制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏 死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主 动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调 控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的 一种现象，

9、而是为更好地适应生存环境而主动争一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争 取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，就像树叶取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，就像树叶 或花的自然凋落一样，借用希腊或花的自然凋落一样，借用希腊“Apoptosis”来来 表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细 胞凋亡。胞凋亡。 （一）凋亡的检测（一）凋亡的检测 细胞凋亡与坏死的区别细胞凋亡与坏死的区别 虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但 它们的过程与表现却有很大差别。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过 程。表现为细胞

10、胀大，胞膜破裂，细胞内容物 外溢，核变化较慢，DNA 降解不充分，引起局 部严重的炎症反应。 凋亡是细胞对环境的生理性、病理性刺激 信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应 答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化 与坏死有明显的不同。 细胞凋亡的生物学意义 胚胎形成、肌体正常发育、衰老和 损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展 和转归等都与细胞凋亡有关。 生物医学的研究热点生物医学的研究热点 凋亡检测凋亡检测 每一步都有检测试剂盒每一步都有检测试剂盒 每一步都有检测试剂盒每一步都有检测试剂盒 1、半胱氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期）检测法（早早期） 2、Annexin V-FITC/

11、PI 法（早期）法（早期） 3、Apo2.7检测法（早期）检测法（早期） 4、TUNEL 法（晚期）法（晚期） 5、DNA含量分析法（晚晚期）含量分析法（晚晚期） 6、细胞凋亡相关基因的流式细胞术检测、细胞凋亡相关基因的流式细胞术检测 流式细胞术检测细胞凋亡流式细胞术检测细胞凋亡 亚二倍体峰（凋亡峰） - PI staining 不能区分凋亡与死亡细胞不能区分凋亡与死亡细胞 Annexin V Assay 建议用于悬浮细胞建议用于悬浮细胞 Annexin V Assay 能够区分死亡与凋亡能够区分死亡与凋亡 细胞周期细胞周期 G1 M G2 S Quiescent cells G0 （二）定量

12、流式细胞术定量流式细胞术 （quantitative flow cytomety) 通过检测标准微球的荧光强度获得 标准曲线，通过标准曲线求得待测细胞的 某种生物分子的精确数值，从而反映在某 种生理病理条件下出现的微细变化，对临 床疾病的研究、诊断及治疗等具有重要意 义。 微球流式芯片技术微球流式芯片技术 CBA(Cytometric Bead Array) 采用夹心法分采用夹心法分 析策略析策略,以微珠以微珠 来捕获可溶性来捕获可溶性 分子。分子。 （三）流式细胞术的临床应用（三）流式细胞术的临床应用 白血病免疫分型白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群淋巴

13、细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞网织红细胞 PNH诊断（诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验血小板活化试验 流式细胞术与造血干细胞移植流式细胞术与造血干细胞移植 流式细胞术与白血病免疫分型流式细胞术与白血病免疫分型 流式细胞的免疫分型流式细胞的免疫分型： 是白血病分型的重要指标，是白血病分型的重要指标，而白血病分 类是选择化疗方案和判断预后的重要依 据。 FAB标准标准(MICM)，形态学、免疫表型染形态学、免疫表型染 色体、分子生物学结合色体、分子生物学结合, 适合于白血病的分型诊断，但不适合用适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊

14、是不是白血病。于确诊是不是白血病。 Minimal residual diseases (MRD) 微小残留病变的检出（MRD）： MRD是白血病复发的主要根源， FCM的高特异性和敏感性可以在患 者缓解期检测是否有残留病变细胞， 早期探测MRD，以免复发。 有证据表明外周血淋巴细胞HLA- B27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎 的发生有很大相关性，利用流式细胞术 进行HLA-B27检测，可同时排除交叉反 应，是目前检测HLA-B27的最好方法。 流式细胞术与强直性脊柱炎流式细胞术与强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 机体免疫状态是衡量机体是否罹患 疾病的重要指标，目前多采用流式

15、细胞 术来检测机体的免疫状态，其中最重要 的指标是检测T,B,NK淋巴细胞的水平。 常用细胞表型及意义常用细胞表型及意义 （cluster of differentiation,CD) CD3 总T细胞 CD4 T辅助/诱导细胞亚群 CD8 T抑制/细胞毒细胞亚群 CD19 B细胞抗原 CD16+56 NK细胞 CD33 髓细胞前体 CD34 多能干细胞 由于T淋巴细胞在人体的免系统中承 担着重要功能，因此当感染发生时，T淋 巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反应 感染的状态和程度。例如：CD4分子有 HIV识别部位，因CD4细胞是HIV病毒的 受体，AIDS患者患者CD4+T细胞细胞明显减少，

16、 该指标是诊断AIDS的重要指标。当病毒 感染发生时（如乙型肝炎、EB病毒和巨 细胞病毒包涵体病毒），CD8+T细胞细胞增多， 对CD8T细胞测定有助于对感染的诊断、 治疗效果的动态观察。 利用流式细胞仪可对器官移植和骨髓移 植后的患者进行监控。当患者CD3+、CD25+持 续增加提示已开始发生排异，CD4+/CD8+ T持 续下降，表明有感染发生，当其比值小于0.2 时必需停用免疫抑制剂。 流式细胞术与移植流式细胞术与移植 其它免疫性疾病分析其它免疫性疾病分析 SLE患者的淋巴细胞变化可 以反应该病的活动情况和器官侵 犯程度，活动或非活动性伴有多 系统疾病，但无肾脏损害的患者 可出现CD4+

17、 CD8+T比值升高， 伴 有严重肾脏损害的SLE患者可出 现低CD4+、高CD8+的现象。 流式细胞术与流式细胞术与PNH 利用流式细胞术检测阵发性睡眠性 血红蛋白尿（PNH），根据血细胞的细 胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂（GPI）所连 接的蛋白，如DAF（CD55）与MIRI （CD59），来确诊此病，比传统的血清 溶血试验具有更高的特异性与敏感性。 血小板： 巨血小板 血小板无力症 网织血小板 流式细胞术与血小板流式细胞术与血小板 血栓性疾与血栓前状态： 由于活化血小板是血栓的 主要成分之一，也是引起血栓 形成的主要原因，所以血小板 活化程度的增高与疾病的发生 发展有关。 流式细胞术与网织红

18、细胞流式细胞术与网织红细胞 DNA非整倍体非整倍体的出现可能是恶变细的出现可能是恶变细 胞的重要标志，胞的重要标志， FCM在肿瘤学上的应用，在肿瘤学上的应用， 主要是利用主要是利用DNA含量测定含量测定，进行癌前病，进行癌前病 变及早期癌变的检出、化疗指导以及预变及早期癌变的检出、化疗指导以及预 后评估等工作。后评估等工作。 癌前病变的癌变率与病变的增生程癌前病变的癌变率与病变的增生程 度一致，而增生程度与度一致，而增生程度与DNA含量的异常含量的异常 改变又呈平行关系。改变又呈平行关系。 流式细胞术与肿瘤流式细胞术与肿瘤 FCM通过精确定量DNA含量，能对癌前病 变的性质和发展趋势作出判断

19、，有助于癌前病 变的早期诊断。 DNA倍体分析有助于临界性肿瘤的 诊断，如卵巢交界性肿瘤，异倍体的出现 与病变的恶性发展有关。 DNA异倍体、高S期细胞比值和高增 殖细胞核抗原（PCNA）表达与细胞增殖 能力、恶性程度和不良预后呈正相关。 为治疗方案和药理学研究提供依据：不同 类型的肿瘤对化疗药物的敏感性不同。可利 用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特 异性药物或非周期特异性药物。 MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白 （P-gp）亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧 光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排除 荧光染料与细胞内P-gp的含量直接相关。当淋 巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对化疗药 物