地鳖虫活性蛋白对人舌癌细胞Tea 8113的抑制作用

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减地鳖虫活性蛋白对人舌癌细胞 Tea-8113的抑制作用（作者：单位：邮编：）【摘要】目的研究地鳖虫蛋白对人舌癌细胞Tea-8113增殖的抑制作用，探索地鳖虫蛋白质的抗肿瘤活性。方法采用MTT法测定地鳖虫蛋白质对人舌癌细胞 Tea-8113增殖的抑制效果。结果地鳖虫 蛋白质在体外能显著抑制人舌癌细胞Tea-8113的增殖，药物浓度0.0902 g ml-1，药物作用72 h抑制率最高，达到92.96 %，并呈 现明显的药物剂量依赖关系。结论地鳖虫蛋白质有较强的体外抗肿瘤 活性。【关键词】地鳖虫活性蛋白Tea-8113细胞MTT法 抗肿瘤活性Abstract :

2、 ObjectiveTo investigate the inhibitory effect ofproteinof Eupolyphaga on human tongue cancer cell lineTea-8113.MethodsThe MTT assay was used to examine the proliferatio nin hibitory activity.ResultsThe protein ofEupolyphaga had obvious an ti-proliferati onactivity on% for 0.0902 g/ml and 72Tea-8113

3、 in vitro in concentration and time dependent manners,the inhibition rate was up to 92.96hours.C on clusi on Theprote inof Eupolyphaga has an obviousinhibitory effect on the proliferation of Tea-8113 in vitro.Key words: Protein of Eupolyphaga; Tea-8113 cell line ; MTT assay; Antineoplasmic activity地

4、鳖虫Eupolyphaga sinensis Walker 又名土元，土鳖，是中国 药典记载的正品动物类药材，具有破瘀血、续筋骨、消肿止痛等药 用功效1，临床主要用于治疗淤血阻滞，癥瘕积聚，跌扑损伤等 症。中医处方亦用其治疗肿瘤，目前将其用于治疗消化道肿瘤的较为 普遍2。本实验室前期工作已证实地鳖虫提取物（Extract from Eupolyphaga sinensis Walker，EES 对肿瘤细胞有显著的细胞毒性作用3。为了深入探讨EES的抑瘤作用，本文以新鲜地鳖为 原料,采用硫酸铵分段盐析,离子交换和SDS-PAG电泳分析等方法， 分离得到地鳖蛋白，探讨该蛋白质对舌癌Tea-8113

5、细胞生长、增殖的影响，为EES抗肿瘤临床应用及其作用机制的深入研究提供实验依 据。1材料与仪器1.1细胞株 人舌癌Tea-8113细胞株由中山大学附属肿瘤医院细胞 库提供，用含10%小牛血清、100U /ml青霉素和100 U /ml链霉素 的RPMI1640培养基，37C，5%CO2培养箱中，完全饱和湿度条件下 培养，34 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。1.2药物及试剂地鳖虫成虫（雌性）购自广州市花鸟市场，由广东 工业大学生药研究室鉴定。RPMI1640培养液、小牛血清均为美国GIBC O公司产品，MTT（噻唑兰）、二甲基亚砜、胰蛋白酶均为美国 AMRESC公司产品，超纯水自制，其余

6、试剂均用国产分析纯。常规培 养。1.3仪器CO2培养箱为美国SHELLAB公司产品，倒置显微镜购自重 庆奥特光学公司，超净工作台为苏净集团产品， 680型酶标仪购自美 国 BIO-RAD公司。2方法2.1地鳖虫活性蛋白质（EES的制备取200 g新鲜地鳖虫剪碎，加入200 ml预冷的0.01 mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.4）,匀浆，再加300ml上述缓冲液，4C浸提过夜，4 000 r/min 离心20 min，弃沉淀， 上清用sevag法提取蛋白质，收集40%- 65腕和度盐析组分4， 透析除盐，层析分离并收集蛋白质组分，洗脱液为含1.0 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH

7、8.0 Tris-HCl 缓冲液梯度洗脱，恒流泵流速为40，10 min收集1管。分别收集各蛋白峰液体，真空冷冻将蛋白质制成 粉末备用。2.2 SDS-PAGE电泳5采用SDS-PAG法分析制备蛋白质组成。浓缩胶浓度5%分离胶浓度12%，考马斯亮蓝G- 250染色，甲醇/冰 乙酸脱色。由低标准蛋白质绘制标准曲线，测定测试样品的迁移距离， 计算相对迁移率（mR），由标准曲线求得测试样品的分子量。2.3地鳖虫活性蛋白对人舌癌Tea-8113细胞的体外抑制作用（MTT 法）6用0.25%胰蛋白酶消化贴壁生长的 Tea-8113细胞，将5.0 X 104/ml细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔100卩

8、l，培养15 h 细胞贴壁后，分别加入 PBS阴性对照）以及终质量浓度（0.010 1 ,0.030 2，0.050 1，0.070 2 和 0.090 2 g/ml ）的 EES各 20 卩 I , 每组均设4个复孔。置饱和湿度、37C、5%CO培养箱中培养24,48, 72 h,结束前46 h各培养孔分别加入 5mg/ml MTT 20卩I,继续 培养4 h，弃培养上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO200卩l溶 解液，用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度（A）值，测定波长为490 nm, 用不含细胞培养液而同样作其他处理组作本底，校正测量值，取4孔A 值平均数,按以下公式计算抑制舌癌细胞的生长

9、抑制率。细胞增殖抑制率（）= : 1-（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组门X 100%2.4统计学处理统计学分析采用 SPSS10.0软件，结果以士 s表示。 实验均重复3次。3 结果3.1地鳖虫活性蛋白质（EES的分离纯化地鳖虫经匀浆、盐析、透 析得到EES粗提物，将该粗提物上 DEAE-32纤维素离子交换柱层析， 介质经预处理后装柱，柱预先用 0. 05 mol/L，pH7. 8的PBS平衡， 上柱后用含 1.0 mol/L NaCl 的 0.02 mol/L pH 8.0 Tris-HCl 缓冲液 梯度洗脱至在280 nm波长无光吸收。洗脱液出现 3个蛋白峰（见图 1）

10、，分别收集各峰蛋白质，经检测峰1和峰2蛋白质含量较低，峰3 蛋白质含量较高。进一步对各蛋白峰进行 MTT检测，蛋白峰1和蛋白 峰2组分对Tea-8113细胞增殖无显著抑制作用，而蛋白峰 3组分能 够显著抑制肿瘤细胞的生长。图1 DEAE-32纤维素离子交换层析柱洗脱 EES3.2 SDS-PAGE电泳结果取DEAL纤维素离子交换层析的活性峰 3 蛋白液进行SDS-PAG电泳，脱色后呈现一清晰蛋白带，表明该蛋白 纯化效果良好，蛋白质基本为单一组分，测得其相对分子质量为 41.3KD。见图 2。图2 EES的SDS-PAG电泳图3.3地鳖虫活性蛋白（EES对Tea-8113细胞的增殖抑制作用 结果

11、显示，5 个 EES浓度（0.010 1，0.030 2，0.050 1，0.070 2 禾口 0.090 2 g/ml ）处理组在3个处理时间内，舌癌Tea-8113细胞增殖被抑制 的情况为：24 h后细胞的增殖抑制率分别为 8.53%, 16.37%, 26.96%, 53.14%和92.06%;48 h后，细胞的增殖抑制率分别为-4.71%, 10.91%, 33.14%, 84.22%和91.90%; 72 h后，细胞增殖抑制率分别为 6.51%, 37.07%, 46.92%, 69.58%和92.96%,显然，这3个处理时间5个浓 度处理组均较对照组明显增高（见表1）。说明EES具

12、有抑制Tea-8113 细胞增殖作用，且对该类癌细胞增殖抑制作用具有明显的时效和量效 关系，随着药物质量浓度的增大和作用时间的增加，Tea-8113细胞增殖的抑制率逐渐增大。当药物浓度为 0.090 2 g/ml，作用时间72 h, 抑制率达92.96 %。相同浓度地鳖虫活性蛋白与对照组比较差异有统 计学意义（P0.01），作用48 h与72 h无显著差异。表1地鳖虫活性 蛋白（EES对Tea-8113细胞增殖的抑制作用4讨论本实验结果表明，浓度为0.010 1 , 0.030 2 , 0.050 1 , 0.070 2和 0.090 2 g/ml的地鳖虫活性蛋白对人舌癌 Tea-8113细胞

13、有显著的抑 制其增殖作用。统计学分析表明：不同浓度的地鳖虫活性蛋白对相同 肿瘤细胞抑制增殖作用的效果不同，具有明显的浓度和时间依赖性， 差异显著(P 0.05)。当细胞数量明显减少，其必然为细胞增殖受到抑制或死亡细胞数量增加这两种现象。由于细胞分裂增殖的实质就是DNA的复制，通过细胞不断经历细胞周期来实现，而细胞周期受细胞内信号传导和多种 因素的精细调节，特别是G0/G1期细胞对外界环境因素敏感并能被刺 激，从而加快或减缓细胞增殖。当细胞周期发生障碍时，细胞增殖将 受到抑制，而DNA合成障碍是细胞周期发生障碍的较常见原因。本 研究以一定浓度地鳖虫活性蛋白处理细胞后，细胞增殖受到极大抑 制，我们认为这种抑制作用不仅仅是直接杀伤肿瘤细胞，一定对细胞增殖过程DNA的复制有所影响。其机制还有待于进一步的研究加以证 实。【参考文献】:1国家药典委员会.中国药典，1部S.北京:化学工业出版社,2005:56.:2邹 玺,刘宝瑞，钱晓萍，等.土鳖虫提取液对人胃低分化腺癌细胞BGC-823的抑制作用J.时珍国医国药，2006,17(9):1695.: