糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化逆转可能性的研究

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化逆转可能性的研究（作者：单位：邮编：）作者：方开云 娄晶磊 肖瑛 石明隽 桂华珍 郭兵 张国忠【摘要】 目的 动态观察u拟平滑肌肌动蛋白（u拟SMA和 目以钙 黏素（E拟cadherin ）在糖尿病（DM大鼠肾组织中的表达，探讨糖 尿病肾病（DN大鼠肾脏纤维化逆转的可能性。方法 选择SD大鼠随 机分为正常对照组、DM组和胰岛素治疗组，链脲佐菌素（STZ诱发 大鼠DM正常对照组和DM组按病程分为2、4、& 12、16、20和24 w组，胰岛素治疗组从第13周起用胰岛素控制血糖至正常水平，分 为16、20和24 w组。检测各组血糖、24

2、h尿蛋白、血肌酐（Scr） 和肾脏指数（Rl）; PAS染色光镜观察肾脏病理改变；免疫组化检测 肾皮质u拟SMA和纤连蛋白（FN的表达；Western印迹检测肾皮质 u拟SMA和E拟cadherin蛋白表达量；RTIPCR检测肾皮质u拟SMA 和FN mRN水平。结果DM组大鼠血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI均较 正常对照组明显升高（Pv 0.05,P V 0.01 ），胰岛素治疗组上述指标均 较DM组显著降低（Pv 0.05,P V 0.01 ）。正常大鼠u拟SMA只在血管 壁表达，DM组2 w开始有少量间质细胞胞浆内有阳性染色，随病程进展间质细胞阳性染色增多；8w时肾小球系膜细胞胞浆内见

3、阳性表 达；从16 w开始在DM大鼠肾小管上皮细胞可见a拟SMA蛋白阳性表 达，胰岛素治疗组未见表达；DM组肾皮质a拟SMA和FN蛋白与mRNA 表达水平较正常对照组显著增多（PV 0.01 ）,胰岛素治疗组则显著低于DM（Pv0.01 ）； DM组取匕adherin蛋白的表达水平较正常对照 组显著降低（Pv0.01 ）,而胰岛素治疗组显著高于 DM组（Pv0.01 ）。 结论 控制血糖可使DN大鼠肾脏一定程度的纤维化逆转，其机制可能 与肾脏固有细胞表型转变被抑制或反转有关。【关键词】a拟平滑肌肌动蛋白；E；丿:钙黏素；糖尿病肾病；大鼠【Abstract Objective To dynami

4、c observe the expressions of a ftismooth muscle actin（a 拟、SMA） and E扌以cadherintoinvestigatethe possibility of renal fibrosis reverse indiabetic nephropathy rats. Methods Streptozotocin 拟 induced diabetic rats were randomly divided into 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 w and 16, 20, 24 wtreatment groups.The t

5、reatment groups were treated with in suli n to con trol blood glucose to no rmal level beginning from the 13 th week. Normal controlgroups wereselected in age拟matching points respectively. Blood glucose,24 h urine prote in, serum creati nine (Scr), renal in dex(RI)of rats were measured. PAS sta inin

6、g was used to observe the renal pathological cha nges. Immun ohistochemicalsta ining,Western blott ing and RT SaPCR were employed to determ ine theexpressionsof a 扌以SMA, E扌以cadherin and fibronectin(FN).Results Comparedwith control group and insulin 拎；treated rats, blood glucose, 24 h urinary protein

7、 excretion,Scr, and RI werein creased remarkably in diabetic rats (Pv 0.05, P v 0.01). I ndiabetic rats, interstitial,mesangial cells and tubulestainings of a 拟SMA were seen at the 2, 8 and 16 th week respectively. The a 拟SMA and FN protein and mRNAwere sig ni fica ntlyupH regulatedin diabetic rats,

8、 whiledowA regulated in the in sulin拟 treated diabetic rats (Pv0.01). The expression of E拟cadherin protein in the cortex was contraryto the expressionof a 拟SMA. ConclusionsRenalfibrosis at early stage in diabetic nephropathy rats can be reversed whe n blood glucose was con trolled and the mecha nism

9、 mayinvoIve in blocking or reversing the phenotypic transition of renal reside nt cells.【Key wordsa 拟SMA;E拟cadherin; Diabetic nephropathy; Rat糖尿病肾病(DN是导致终末期肾衰竭的主要病因，肾小管 拟间质 纤维化是DN重要的病理改变。过去认为肾脏纤维化是不可逆转的， 近年研究表明，部分肾脏纤维化可以逆转1, 2,但DN肾脏纤维化 是否可以逆转及其机制尚需进一步证实。肾脏纤维化的基本病理改变是细胞外基质(ECM的过度沉积，进而取代了肾脏固有细胞，破坏 肾脏正

10、常结构。a拟平滑肌肌动蛋白(a拟SMA是成纤维细胞活化和 肌成纤维细胞(MFB)的标志性蛋白，因此我们通过动态观察a 拟SMA E拟钙黏素(E拟.cadherin)和纤连蛋白(FN)在糖尿病(DM发展过程及 胰岛素治疗后大鼠肾皮质中的表达，初步探讨 DN肾脏纤维化逆转的 可能性及其机制。1材料与方法1.1动物SD大鼠，清洁级，雄性，体重180200 g,由上海西普尔 拟比凯实验动物有限公司提供许可证号：Scxy (沪)200取10002。1.2 主要试剂 链脲佐菌素(STZ Sigma)，兔抗大鼠Ecadherin、FN多克隆抗体、小鼠抗大鼠a拟SMA和B拟actin单克隆抗体、羊抗 兔或小鼠

11、IgG拟HRP(Santa Cruz )、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒、ECM试剂盒(武汉博士德)；EZ Spin Column RNA Purification Kit(BBI ) ， RevertAidTM FirstStrand cDNA Synthesis Kit(Ferme ntas)，Taq 酶(TaKaRa，a tSMA 卩“和 拟 act in 引物合 成(上海生工)。1.3实验方法1.3.1 动物模型及分组大鼠随机分成正常对照组、DM组和胰岛素治疗组。正常对照组和 DM组又分为2、4、8、12、16、20和24 w组(n=6)，DM组予以尾静脉注射STZ 55 mg/kg

12、，72 h后测血糖，血糖 16.7 mmol/L者入选。正常对照组注射同体积的 STZ溶媒。胰岛素 治疗组从第13周开始皮下注射精蛋白锌胰岛素，实行个体化剂量， 以血糖控制在47 mmol/L,尿糖阴性为准分为16、20和24 w组(n=6)。 所有大鼠予标准饲料喂养，自由饮水。于处死前1d用代谢笼收集 24 h尿测尿蛋白；股动脉取血测血糖、血肌酐（Scr）;处死大鼠，取 双肾，分别于4%多聚甲醛固定及-80 C保存。132 生化指标测定氧化酶法测血清葡萄糖，考马斯亮蓝法测尿蛋 白,苦味酸法测Scr,均按试剂盒说明书操作（四川迈克科技有限责任 公司）。133 肾组织病理检查 多聚甲醛固定之肾组

13、织制成 3卩m厚的石 蜡切片，行PAS染色，光镜观察肾组织形态结构变化。以肾重（ mg 与体重（g）比值作为肾脏指数（RI）。1.3.4 免疫组化石蜡切片脱蜡水化，经微波热修复抗原及5%BSA寸 闭后，分别加入u拟SMA（ 1 : 200）和FN抗体（1 : 100），4C孵育过 夜。加入生物素化二抗，室温下孵育 30 min ;滴加SABC式剂；DAB 显色。PBS代替一抗，作阴性对照。双盲观察染色切片，每张切片随 机取10个不重复高倍（400倍）视野,计数细胞的阳性染色，取均值表 示久ttiSMA的表达。FN的表达程度则参考郭兵等3方法计数，以 10个高倍视野的阳性点数取均值。1.3.5

14、Western印迹 取-80 C保存的肾皮质100 mg加裂解液匀浆， 离心取上清测定蛋白含量，每泳道加 160卩g蛋白质，经SDS：PAGE 垂直凝胶电泳后，电转移至 PVDF膜。5%兑脂奶粉室温封闭2 h，TBST 洗膜后分别加u拟SMA抗体（1 : 400）和E以cadherin （1 : 200） 4C 孵育过夜；加相应二抗室温孵育 2 h，ECL试剂曝光显影。用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与B 拟act in抗体（1 : 300）孵育。 凝胶成像系统（ChmioDox,Bio拟Rad）和Quantity One软件进行图像分 析。以B拟act in蛋白条带作内参照，结果用靶蛋白

15、/ B拟act in比值 表示。136 RT 拟PCR按 EZ Spin Column RNA Purification Kit 说明提 取总RNA核酸蛋白分析仪检测含量，RNA勺吸光度（A）260 nm/280 nm比值均在1.92.0，逆转录合成cDNA PCR的引物序列、退火温 度及扩增片段长度见表1。PCF产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成 像系统扫描分析。结果用靶基因/ B拟act in比值表示。表1 PCR引物序列及扩增条件引物序列片段长度（bp）退火温度C）循环数a拟SMA上游5 拟 CTCTGGTGTGTGACAATGGTCC 2565840 下游FN 上 游拟 cgaagc

16、tcgttatagaagGagtg拟 GCAAGCCTGAACCTGAAGaGACC 4466240上游 5拟 CCTGGTGTCCTGATCATTGCaTC B 拟 actin拟 GAAATCGTGCGTGACATTAAG49057.340 下游 5拟 ctagaagcatttgcgGTgga1.4统计学分析 数据以x士 s表示，采用SPSS11.5软件，组间比较采用方差齐性检验，作单因素方差分析。2结果2.1生化指标测定结果 如表2所示DM组各时点的血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI较正常对照组明显升高（Pv0.05,P v0.01 ），胰岛素治 疗组上述各指标比相应时点 DM组明显下降（

17、Pv0.01 ），与对照组相 比差异无显著性（P 0.05）。2.2肾组织病理变化PAS染色（图1）见正常大鼠肾小球及肾小管 结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整 ，间质中未见炎症 细胞浸润。DM组大鼠4 w后可见肾小球系膜区扩张，肾小管上皮细 胞变性，部分肾小管腔内有细胞和管型，管腔扩张，上皮细胞萎缩，间 质有较多细胞浸润，肾小管基底膜不规则增厚，肾小管拟间质PAS阳 性染色物明显增多。胰岛素治疗组大鼠肾脏病变均有不同程度改善，肾小球系膜区和肾小管拟间质PAS染色阳性物质明显减少，肾小管上 皮细胞病变明显改善。2.3免疫组化结果 见表3。图2示正常大鼠口拟SMA只在血管壁表 达。DM

18、组2 w开始有少量间质细胞胞浆内有阳性染色，随病程进展 间质细胞阳性染色增多；8w时肾小球系膜细胞胞浆内见阳性表达； 16 w时部分糖尿病大鼠肾小管上皮细胞胞浆内可见阳性表达。胰岛 素治疗组均未见间质细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞表达a 拟SMA图3示正常对照组大鼠肾小管基底膜及肾小球 FN呈线性表达， 肾间质无阳性表达，糖尿病组大鼠肾小球及肾小管 拟间质FN表达从 2 w开始逐渐增多，12 w后持续在较高水平，主要表达在肾小管周围 肾间质和肾小球系膜区，胰岛素治疗组大鼠肾组织内FN表达明显减少。2.4 Western印迹结果 见表4和图4。正常对照组大鼠肾皮质有a 拟SMA表达，DM组

19、大鼠2 w其表达开始增加，并随病程的延长而逐渐 增多（Pv 0.05 ）， 12 w时达咼峰，以后一直处于较咼水平。胰岛素 治疗组的表达则明显下降（Pv 0.05 ） ,24 w时几乎恢复到正常对照 组水平。DM组大鼠E拟cadherin蛋白表达显著低于正常对照组（P V 0.05），胰岛素治疗组的表达则明显较 DM组增加（PV 0.05 ）。2.5 u拟SMA和FN mRNA表达水平 见表5和图5。正常对照组可检 测到两者mRNA各时点DM组两者的mRN冰平较正常对照组显著增 加（PV 0.05 ）,且随病程延长呈递增趋势，16 w后维持在较高水平。 胰岛素治疗组的mRNA匕同时点DM组明显

20、下降（Pv 0.05 ）,与正常对 照组比较差异无显著性。表2各组大鼠血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI 与正常对照组比较：1） PV0.05 , 2） PV0.01 ；与同时点DM组比较： 3） P V 0.01 ;下表同表3各组大鼠肾皮质口拟SMA和FN免疫组化阳 性表达程度表4各组大鼠肾皮质a拟.SMA和ED：cadherin蛋白表达相 对水平（靶蛋白/ B拟act in灰度比值）与正常对照组比较：1） P V 0.05 ；与同时点DM组比较：2） P V 0.05，下表同表5各组大鼠肾 皮质a拟SMA和FN mRNA表达相对水平3 讨论在正常组织中，ECM的产生和降解处于一个平衡状态，

21、这种平衡主 要由ECM勺降解酶类，如基质金属蛋白酶（MMPs、组织型纤溶酶原激 活物等调节。传统理论认为，基质降解酶可以减轻肾脏纤维化，延缓 肾功能恶化。然而近年研究结果却相反，女口MMP2在体外可诱发肾小管上皮细胞转化（EMT4，过度表达MMP2的转基因鼠，发生小 管肥大、小球硬化和小管拟间质纤维化5。以往也认为纤维蛋白溶 解酶可以通过降解基质蛋白而保护肾脏， 可是在纤溶酶原基因敲出小 鼠中，将小鼠进行输尿管结扎后并未发现纤维化加重；同时，还在小 鼠体内发现胶原沉积减少6。因此相关实验提示，基质降解酶是否 有利于肾脏纤维化的逆转仍然存在争议。肾脏固有细胞包括成纤维细胞、系膜细胞、上皮细胞等，

22、这些细胞 在各种损伤因素的刺激下，发生MFB转变，最终成为分泌基质蛋白的 效应细胞乙8，效应细胞不仅能合成分泌 ECM还能分泌蛋白酶 抑制子、细胞因子、炎症介质，以旁分泌的方式募集邻近细胞，放大 致纤维化的效应。因此，已经发生表型改变的细胞能否回到其正常表 型是肾脏纤维化逆转的关键。本实验从2 w开始DM组大鼠口拟SMA表达即显著增加，免疫组化染色显示，DM大鼠2 w时肾间质细胞胞浆内有阳性染色，8 w可见部分 肾小球系膜细胞胞浆阳性染色，16 w时部分DM大鼠肾小管上皮细胞 胞浆内可见阳性表达，并随病程延长细胞阳性染色增多，提示在DM大鼠肾组织中有成纤维细胞活化和系膜细胞、肾小管上皮细胞向M

23、FB细胞表型转变。同时我们还观察到随着 DM的发展，肾小球系膜区和 肾小管间质区FN增多，与MFB增加相一致，提示DM大鼠肾脏ECM成 分FN沉积增多可能来源于MFB在胰岛素治疗组，FN和u拟SMAg白和mRN表达显著减少，通过免 疫组化我们观察到口拟SMA只表达于血管，说明MFB减少，提示胰岛 素控制血糖后可能通过抑制或逆转肾脏固有细胞的表型转化， 从而减 少了 FN等ECM勺生成，减轻肾脏病理改变。Yang 9、Zesiberg 10等的研究提示肝细胞生长因子（HGF）、骨形态发生蛋白（BMP）】17可以诱导发生EMT的细胞再转变为上皮细胞(MET,提出至少在早期移出或阻断致病因子，EMT

24、是可以逆转的。本实验中DM大鼠肾小管上皮细胞胞浆内出现a 拟SMA勺阳性表达在 16 w,而胰岛素治疗组从13 w开始治疗，提示胰岛素控制血糖可能 在早期阻断或逆转了高糖刺激下肾小管上皮细胞的EMTE拟cadherin是上皮细胞产生的也是上皮细胞的标志性蛋白，起着 维持细胞连接和极性的重要作用。本组DM大鼠的E拟cadherin较正常对照组显著减少，而胰岛素治疗组则较同时点DM显著增加，提示了增多的Ecadherin有可能来源于肾小管上皮细胞增多，而增多的 上皮细胞有可能是MFB通过MET或 EMT被阻止而使肾小管上皮细胞维 持原有表型的机制转变而来。虽然DN肾脏纤维化的机制尚未阐明，其纤维化

25、的逆转亦取决于许多 因素，胰岛素治疗也并不能完全防止 DM病人进展为终末期肾衰竭， 但本结果提示DN经胰岛素治疗后，一定程度的肾脏纤维化可被逆转， 而这种逆转可能与肾脏固有细胞表型转化有关。【参考文献】1 Boffa JJ,Ying L,Placier S， et al.Regression of renalvascular and glomerular fibrosis:role of angiotensinIIreceptor an tag onism and metalloprote in ases J.J Am SocNephrol，2003;14(13):1132 拟44.2 Ada

26、mczakM, Gross ML AmanrK,et al.Reversal of glomerularlesi onsinvo Ivescoord in atedrestructuri ngof glomerularmicrovasculatureJ.J Am Soc Nephrol,2004;15(12):3063拟72.3 郭兵，肖瑛，万昌武，等.糖尿病大鼠肾小管 TGF慎3 1和MAPK1/3表达的动态观察J.中国病理生理杂志,2004 ;20(9):1681 拟 5.4 ChengS, Lovett DH.Gelatinase A (MMp)；2) is necessary and sufficie nt for renal tubular cell epithelial 拎;mese nchymal transformation J.Am J Pathol,2003 ； 162(6) : 1937拟49.5 Che ng S,Pollock AS ， Mahimkar R,et al.Matrix metalloprote in ase 2 and baseme nt membra nen tegrity : a unifying m