理学蛋白质共价结构

1、1一、蛋白质通论一、蛋白质通论w 蛋白质：蛋白质：w 核酸：核酸：蛋白质和核酸构成了细蛋白质和核酸构成了细胞内原生质的主要成分，胞内原生质的主要成分，而原生质是生命现象的而原生质是生命现象的物质基础物质基础 结构、功能、分离纯化、酶结构、功能、分离纯化、酶信息物质信息物质 w 糖：糖： 能源物质能源物质w 脂：脂： 生物膜成分生物膜成分w 氨基酸：蛋白质的基础氨基酸：蛋白质的基础激素、维生素、辅酶激素、维生素、辅酶2（一）蛋白质的分类（一）蛋白质的分类传统分类法传统分类法蛋白质蛋白质单纯蛋白质单纯蛋白质:只由氨基酸组成只由氨基酸组成缀合蛋白质缀合蛋白质氨基酸氨基酸辅助成分辅助成分3（一）蛋白质

2、的分类（一）蛋白质的分类1、清蛋白清蛋白(albumin)：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。为饱和硫酸：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。为饱和硫酸 铵沉淀。广泛存在于生物体内，如血清清蛋白、乳清蛋白铵沉淀。广泛存在于生物体内，如血清清蛋白、乳清蛋白2、球蛋白、球蛋白(globulin)：为半饱和硫酸铵沉淀，不溶于水而溶于稀盐：为半饱和硫酸铵沉淀，不溶于水而溶于稀盐 溶液的称优球蛋白溶液的称优球蛋白(euglobulin)；溶于水的称假球蛋白；溶于水的称假球蛋白(pseu- doglobulin)。普遍存在于生物体内，如血清球蛋白、肌球蛋。普遍存在于生物体内，如血清球蛋白、肌球蛋 白和植物种子球蛋白

3、等。白和植物种子球蛋白等。3、谷蛋白、谷蛋白(glutelin)：不溶于水、醇及中性盐溶液，但易溶于稀酸或：不溶于水、醇及中性盐溶液，但易溶于稀酸或 稀碱。如米谷蛋白和麦谷蛋白。稀碱。如米谷蛋白和麦谷蛋白。4、谷醇溶蛋白、谷醇溶蛋白(prolamine)：不溶于水及无水乙醇，但溶于：不溶于水及无水乙醇，但溶于7080 乙醇中。脯氨酸和酰胺较多，非极性侧链较极性侧链多。主乙醇中。脯氨酸和酰胺较多，非极性侧链较极性侧链多。主 要存在于植物种子中。如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白。要存在于植物种子中。如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白。5、组蛋白、组蛋白(histone)：溶于水及稀酸，但为稀氨水所沉淀。分子中组

4、氨：溶于水及稀酸，但为稀氨水所沉淀。分子中组氨 酸和赖氨酸较多，分子呈碱性。如小牛胸腺组蛋白等。酸和赖氨酸较多，分子呈碱性。如小牛胸腺组蛋白等。6、鱼精蛋白、鱼精蛋白(protamine)：溶于水及稀酸，不溶于氨水。分子中碱性：溶于水及稀酸，不溶于氨水。分子中碱性 氨基酸很多，分子呈碱性。如鲑精蛋白（氨基酸很多，分子呈碱性。如鲑精蛋白（salmin）。）。7、硬蛋白、硬蛋白(scleroprotein)：不溶于水、盐、稀酸及稀碱。是动物体内：不溶于水、盐、稀酸及稀碱。是动物体内 作为结缔及保护功能的蛋白质。例如，角蛋白、胶原、网硬作为结缔及保护功能的蛋白质。例如，角蛋白、胶原、网硬 蛋白和弹性

5、蛋白。蛋白和弹性蛋白。单纯蛋白质的分类单纯蛋白质的分类4（一）蛋白质的分类（一）蛋白质的分类1糖蛋白：含糖类。许多胞外基质蛋白质属糖蛋白，如纤连蛋白、糖蛋白：含糖类。许多胞外基质蛋白质属糖蛋白，如纤连蛋白、 胶原蛋白和蛋白聚糖，胶原蛋白和蛋白聚糖，球蛋白。球蛋白。2脂蛋白：含三酰甘油、胆固醇、磷脂。如血浆脂蛋白，包括脂蛋白：含三酰甘油、胆固醇、磷脂。如血浆脂蛋白，包括HDL (脂蛋白脂蛋白) 和和LDL (脂蛋白脂蛋白) 等。等。3核蛋白：辅基为核酸。如核糖体核蛋白：辅基为核酸。如核糖体 (含含RNA)，AIDS病毒病毒 (含含RNA) 和和 腺病毒腺病毒 (adenovirus，含，含DNA

6、).4磷蛋白：含与磷蛋白：含与Ser、Thr和和Tyr残基的羟基酯化的磷酸基。如酪蛋白残基的羟基酯化的磷酸基。如酪蛋白 糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶 a。5金属蛋白：如铁蛋白金属蛋白：如铁蛋白 (ferritin) 含铁，乙醇脱氢酶含含铁，乙醇脱氢酶含Zn，细胞色素，细胞色素 氧化酶含氧化酶含Cu和和Fe，固氮酶含，固氮酶含Mo和和Fe ， 丙酮酸羧化酶含丙酮酸羧化酶含Mn。6血红素蛋白：金属蛋白的亚类。辅基为血红素，是卟啉化合物，卟血红素蛋白：金属蛋白的亚类。辅基为血红素，是卟啉化合物，卟 啉中心含啉中心含Fe。如血红蛋白、细胞色素。如血红蛋白、细胞色素c、过氧化氢酶、过氧化氢酶 和硝酸盐还原酶

7、。和硝酸盐还原酶。7黄素蛋白黄素蛋白(flavoprotein)：含黄素，辅基为：含黄素，辅基为FMN和和FAD。如琥珀酸。如琥珀酸 脱氢酶脱氢酶(含含FAD)、NADH脱氢酶脱氢酶(含含FMN)、二氢乳清酸脱、二氢乳清酸脱 氢酶氢酶(含含FAD和和FMN)和亚硫酸盐还原酶和亚硫酸盐还原酶(含含FAD和和FMN) 缀合蛋白质的分类缀合蛋白质的分类5（一）蛋白质的分类（一）蛋白质的分类蛋白质按生物学功能分类蛋白质按生物学功能分类1 酶酶(enzyme)：如核糖核酸酶、胰蛋白酶、果糖磷酸激酶、乙醇脱氢酶、：如核糖核酸酶、胰蛋白酶、果糖磷酸激酶、乙醇脱氢酶、 过氧化氢酶和苹果酸酶（过氧化氢酶和苹果酸

8、酶（malic enzyme）2调节蛋白调节蛋白(regulatory protein)：如胰岛素、促生长素：如胰岛素、促生长素(GH)、促甲状腺素、促甲状腺素 (TSH)、乳糖阻抑物、核转录因子、乳糖阻抑物、核转录因子1(NF1)和分解代谢物激和分解代谢物激 活剂蛋白活剂蛋白3转运蛋白转运蛋白(transport protein)：如血红蛋白、血清清蛋白和葡糖转运蛋白：如血红蛋白、血清清蛋白和葡糖转运蛋白4储存蛋白储存蛋白(storage protein)：如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和铁蛋白：如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和铁蛋白5收缩和游动蛋白收缩和游动蛋白(contractile and

9、 motile protein)：肌动蛋白、肌球蛋：肌动蛋白、肌球蛋 白、微管蛋白、动力蛋白白、微管蛋白、动力蛋白 (dynein) 和驱动蛋白和驱动蛋白 (kinesin)6结构蛋白结构蛋白(structural protein)：如：如角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、 丝蛋白和蛋白聚糖丝蛋白和蛋白聚糖7支架蛋白支架蛋白(scaffold protein)：如胰岛素受体底物：如胰岛素受体底物1、A激酶锚定蛋白和激酶锚定蛋白和 信号传递转录激活剂信号传递转录激活剂8保护和开发蛋白保护和开发蛋白(protective and exploitive protein)：如免疫

10、球蛋白、凝：如免疫球蛋白、凝 血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇（蜂）毒蛋白、白喉毒血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇（蜂）毒蛋白、白喉毒 素和蓖麻毒蛋白素和蓖麻毒蛋白9异常蛋白异常蛋白( (exotic protein) )：如应乐果甜蛋白、节肢弹性蛋白和胶质蛋白：如应乐果甜蛋白、节肢弹性蛋白和胶质蛋白 6（一）蛋白质的分类（一）蛋白质的分类根据形状和溶解度分类根据形状和溶解度分类1.1.纤维状分子纤维状分子 ( (fibrous protein) ) 线性分子，有规则，线性分子，有规则，细棒或纤维状细棒或纤维状结构蛋白不溶于水；结构蛋白不溶于水；血纤蛋白原溶于水血纤蛋白原溶于水原胶原原胶原 胶原纤

11、维胶原纤维300nm，1.5nm7（一）蛋白质的分类（一）蛋白质的分类2. 2. 球状分子球状分子( (globular protein) ) 疏水链在球内，外部是亲水侧链疏水链在球内，外部是亲水侧链 水溶性好，细胞内大部分水溶性蛋白水溶性好，细胞内大部分水溶性蛋白 质是球蛋白质是球蛋白 3. 3. 膜蛋白膜蛋白 (membrane protein) 疏水侧链暴露于外部。疏水侧链暴露于外部。 氨基酸组成：极性残基比球蛋白少氨基酸组成：极性残基比球蛋白少 水不溶性蛋白水不溶性蛋白8（二）化学组成和分子量（二）化学组成和分子量w 蛋白质的元素组成：蛋白质的元素组成： C：50%，H：7%，O：23

12、%，N：16%， S： 03%，其它，其它 97%，已知相对分子量，已知相对分子量 Sanger法测序步骤法测序步骤1、测定多肽链数目、测定多肽链数目 确定确定N-末端或末端或C-末端残基的摩尔数末端残基的摩尔数末端残基的摩尔数末端残基的摩尔数蛋白质摩尔数蛋白质摩尔数 1 多条肽链多条肽链 1 单体，一条肽链单体，一条肽链末端残基不相同时，表明蛋白质由不同肽链组成末端残基不相同时，表明蛋白质由不同肽链组成 31变性剂：变性剂： 8M 尿素，尿素，6M 盐酸胍盐酸胍断裂二硫桥断裂二硫桥2、建立测序参考点、建立测序参考点 鉴定末端残基，测定每条多肽链的氨基酸组成鉴定末端残基，测定每条多肽链的氨基酸

13、组成3、降解多肽链、降解多肽链 得到二套以上的肽段进行组成和末端残得到二套以上的肽段进行组成和末端残 基分析基分析4、氨基酸测序、氨基酸测序（Edman法、酶解法、质谱法法、酶解法、质谱法）5、构建完整肽链、构建完整肽链6、确定二硫键位置、确定二硫键位置拆分亚基拆分亚基32(二)、N-末端和C-末端氨 基酸残基的鉴定 1、N-末端分析末端分析1）二硝基氟苯（）二硝基氟苯（DNFB 或或 FDNB）法）法 Sanger反应反应FNO2O2N+HCRH2Nbase+F-DNP-p pe ep pt ti id de eCOpeptideHNNO2O2NHC CROpeptide33(二)、N-末端

14、和C-末端氨基酸残基的鉴定2）丹磺酰氯（）丹磺酰氯（dansyl chloride， DNS）法）法 5-dimethylamino- naphthaline-1- sulfonyl chloride优点：灵敏度比优点：灵敏度比DNFB法高法高100倍倍 NNCH3H3CCH3H3CSNHHCCOOHOORS OONHHCCROpeptideNCH3H3CS OOCl+HCRH2NCOpeptidebaseH2ODNS-peptide+amino acidsH+343）苯异硫氰酸酯（）苯异硫氰酸酯（PITC）法）法 Edman法法 特点：能依次从肽的特点：能依次从肽的N-端逐一切割氨基酸残基端

15、逐一切割氨基酸残基N CS +HCRH2NCO多多肽肽NHNHSCHCR弱弱碱碱O多多肽肽H+NNHSCHCROPTH-氨氨基基酸酸苯苯乙乙内内酰酰硫硫脲脲衍衍生生物物 4）氨肽酶法）氨肽酶法 亮氨酸氨肽酶，焦谷氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶，焦谷氨酸氨肽酶 特点：从肽链特点：从肽链 N- 端逐一降解氨基酸，适用于端逐一降解氨基酸，适用于N- 端的氨基酸残基被封闭的肽（如环肽）端的氨基酸残基被封闭的肽（如环肽） 35(二)、N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定 2、C-末端分析末端分析1）肼解法）肼解法： H2NHC CHNR1OCHNOHCRn-1COHNHCRnCOOH无无水水H H2 2N NN

16、NH H2 2100H2NHC C NHNH2+R1O+ H2NHC C NHNH2+Rn-1OH2NHC COOHRnGln、Asn、Cys被破坏被破坏, Arg转变为鸟氨酸转变为鸟氨酸362）还原法）还原法 还原，水解，用还原，水解，用HPLC等方法分离鉴定等方法分离鉴定3）羧肽酶法）羧肽酶法 特点：从羧端逐一降解氨基酸特点：从羧端逐一降解氨基酸 CPA：水解除：水解除 Pro、Arg、Lys 外的所有外的所有 C-末端残基末端残基 CPB：只水解：只水解Arg、Lys为末端的肽链为末端的肽链 CPY：所有氨基酸：所有氨基酸37( (三三) )、二硫键断裂、二硫键断裂38( (四四) )、

17、氨基酸组成分析、氨基酸组成分析酸水解方法酸水解方法：6 mol/L HCl, 110 特点：氨基酸不消旋特点：氨基酸不消旋 缺点：缺点：Trp完全破坏完全破坏 Ser、Thr、Tyr部分破坏部分破坏 Gln、Asn的酰氨基被水解的酰氨基被水解碱水解方法碱水解方法：5mol/L NaOH，110 特点：特点：Trp可定量回收可定量回收 缺点：大部分氨基酸被破坏缺点：大部分氨基酸被破坏 39( (四四) )、氨基酸组成分析、氨基酸组成分析AA残基残基鸡溶菌鸡溶菌酶酶牛牛乳乳球蛋白球蛋白菠菜铁氧菠菜铁氧还蛋白还蛋白烟草花叶病烟草花叶病毒外壳蛋白毒外壳蛋白马细胞马细胞色素色素c牛核糖牛核糖核酸酶核酸酶

18、人碳酸人碳酸酐酶酐酶蚕丝心蚕丝心蛋白蛋白Ala12159146121945Val6971439179Leu82181262202Ile6104963101Pro284844177Met24002420Phe342843114Trp62131061Gly123661231674Ser1077160153017Thr788161010142Cys85512812Tyr344446823Asn135210510171Gln39493790Asp81111835144Glu2169795134Lys614421910185Arg1131112473His121034112总数总数12916097158

19、10412426020640( (五五) )、多肽链的部分裂解、多肽链的部分裂解降解分离 1、酶切法：、酶切法： 优点：专一性强，断裂点明优点：专一性强，断裂点明 确，反应产率高确，反应产率高 酶：蛋白水解酶（酶：蛋白水解酶（protease） 常见蛋白酶：常见蛋白酶： 胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶， 嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶等嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶等 在肽链内有固定的酶切位在肽链内有固定的酶切位 点，也叫内切酶或内肽酶点，也叫内切酶或内肽酶 （endopeptidase） 411) 胰蛋白酶胰蛋白酶(Trypsin) 特点：水解碱性氨基酸的特点：水解碱性氨基酸的-COOH形成

20、的肽键形成的肽键 马来酸酐可保护马来酸酐可保护Lys 1,2-环己二酮能修饰环己二酮能修饰Arg胍基胍基 2）糜蛋白酶）糜蛋白酶(Chymotrypsin) 水解水解-COOH端为芳香族的氨基酸端为芳香族的氨基酸 也水解疏水氨基酸也水解疏水氨基酸Leu、Met或或His的的 -COOH端肽键端肽键 裂解能力受邻近氨基酸残基影响裂解能力受邻近氨基酸残基影响 碱性残基和酸性残基碱性残基和酸性残基 433）嗜热菌蛋白酶（）嗜热菌蛋白酶（Thermolysin） 依赖依赖Zn2和和Ca2，可用来断裂较短的多肽链，可用来断裂较短的多肽链4）胃蛋白酶（）胃蛋白酶（Pepsin） 要求芳香氨基酸和疏水氨基酸

21、，断裂肽键要求芳香氨基酸和疏水氨基酸，断裂肽键 的二侧残基都是疏水氨基酸。的二侧残基都是疏水氨基酸。最适最适pH25）木瓜蛋白酶（）木瓜蛋白酶（Papain） 对免疫球蛋白有特殊作用对免疫球蛋白有特殊作用6）葡萄球菌蛋白酶）葡萄球菌蛋白酶 (Staphylococcal protease) 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 (pH 7.8): Glu和和Asp的的-COOH端肽键端肽键 碳酸氢铵缓冲液碳酸氢铵缓冲液 (pH 7.8) 或醋酸缓冲液或醋酸缓冲液 (pH 4.0)： 只断裂只断裂Glu残基残基-COOH端的肽键端的肽键44( (五五) )、多肽链的部分裂解、多肽链的部分裂解2、化学法、化学法

22、优点：专一性好，肽段大，适于自动化测序优点：专一性好，肽段大，适于自动化测序 溴化氰断裂法：溴化氰断裂法： CNBr 只断裂只断裂-COOH端为端为Met的肽键，生的肽键，生 成肽酰高丝氨酸成肽酰高丝氨酸CH3SCH2CH2CHCONHNBrCNBr-CH3S+CH2CH2CHCONHNHCNBr-甲硫氨酸溴化氰基硫.H3CCHCON.CH2N+HBr-H2OH3N+肽H3CCHCON.HH溴化亚氨内酯H肽酰高丝氨酸内酯H3CSCN+H2CO46( (六六) )、肽段的氨基酸测序、肽段的氨基酸测序第一步：偶联反应第一步：偶联反应条件：弱碱性，条件：弱碱性，PITC只与未质子化的游离只与未质子化

23、的游离NH2反应反应 1、Edman化学测序法（化学测序法（1950）H2N CHCHN CHCHNPR1OR2OpH9N CSHN CSHNCHCHN CHCHNR1R2OOPPTC-P苯氨基硫甲酰肽47( (六六) )、肽段的氨基酸测序、肽段的氨基酸测序第二步：环化断裂第二步：环化断裂HNCSHN CHCHNCHCHNR1R2OOPPTC-PCF3COOH无无水水CNHCR1CSHN+H2N CHCHN PR2OOATZ(噻噻唑唑啉啉酮酮苯苯胺胺）CNHCR1CSHNOATZ(噻噻唑唑啉啉酮酮苯苯胺胺）1M HClH2OHN CSHN CHCR1OPTC- -氨氨基基酸酸OHNHCONHC

24、SPTH-氨氨基基酸酸R第三步：转化反应第三步：转化反应 PTH-氨基酸非常稳定，氨基酸非常稳定，max = 268nm48( (六六) )、肽段的氨基酸测序、肽段的氨基酸测序优点：连续测定优点：连续测定60-70个残基个残基 缺点：繁琐、工作量大缺点：繁琐、工作量大发展：发展：DNS-Edman降解，荧光标记降解，荧光标记PITC 2、酶降解法：、酶降解法： 外切酶：氨肽酶和羧肽酶外切酶：氨肽酶和羧肽酶 限制：只能测定末端附近很少几个残基限制：只能测定末端附近很少几个残基3、质谱法：、质谱法： 电喷雾电离质谱电喷雾电离质谱(ESI)可进行小肽测序可进行小肽测序49( (七七) )、确定肽段次

25、序、确定肽段次序OUS SEOPS WTOUEOVE VERL RLA APSHOWT HO借助重叠肽段确定氨基酸顺序：借助重叠肽段确定氨基酸顺序：末端残基：末端残基：H S末端肽段：末端肽段：HOWT APS序列序列: HOWTOUSEOVERLAPS 借助于重叠肽确定肽段在原肽链中的顺借助于重叠肽确定肽段在原肽链中的顺序，进而拼凑出完整肽链的氨基酸顺序序，进而拼凑出完整肽链的氨基酸顺序 N末端残基：末端残基：H， C末端残基：末端残基：S50( (八八) )、二硫键的确定、二硫键的确定 使用切点多的胃蛋使用切点多的胃蛋白酶水解肽链，生成白酶水解肽链，生成较小的含二硫桥的肽较小的含二硫桥的肽

26、段混合物，进行双向段混合物，进行双向电泳电泳51（一）蛋白质的分类（一）蛋白质的分类根据形状和溶解度分类根据形状和溶解度分类1.1.纤维状分子纤维状分子 ( (fibrous protein) ) 线性分子，有规则，线性分子，有规则，细棒或纤维状细棒或纤维状结构蛋白不溶于水；结构蛋白不溶于水；血纤蛋白原溶于水血纤蛋白原溶于水原胶原原胶原 胶原纤维胶原纤维300nm，1.5nm52（二）化学组成和分子量（二）化学组成和分子量w 蛋白质的元素组成：蛋白质的元素组成： C：50%，H：7%，O：23%，N：16%， S： 03%，其它，其它 1% (金属离子等金属离子等)w 复杂体系中蛋白质含量的估

27、算：复杂体系中蛋白质含量的估算： = = N16 % N 6.2553（三）蛋白质结构的组织层次（三）蛋白质结构的组织层次蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 多肽链由氨基酸首尾相多肽链由氨基酸首尾相连而成，连而成，蛋白质的一级结构就蛋白质的一级结构就是多肽链的氨基酸序列是多肽链的氨基酸序列 一级结构含有结构信息，一级结构含有结构信息，包括蛋白质分子如何折叠，走包括蛋白质分子如何折叠，走向，在何处需要向，在何处需要-螺旋或螺旋或-折叠折叠54( (三三) )、活性多肽、活性多肽 三肽：谷胱甘肽三肽：谷胱甘肽 -Glu-Cys-Gly，维持，维持 红细胞内蛋白质（如血红蛋白）红细胞内蛋白质（如血红蛋白） 中中Cys-SH处于还原态处于还原态55( (三三) )、活性多肽、活性多肽 -鹅膏蕈碱是一个环状八肽，能与真核鹅膏蕈碱是一个环状八肽，能与真核生物的生物的RNA聚合酶结合，抑制其酶活性，聚合酶结合，抑制其酶活性，使使RNA的合成停止。但它不影响原核生物的合成停止。但它不影响原核生物的的RNA合成合成563）苯异硫氰酸酯（）苯异硫氰酸酯（PITC）法）法 E