精子fish sop

1、细胞遗传学实验室质量管理手册人精子染色体荧光原位杂交（fish）标准操作规程文件编号：sop(技)4024第1页 共5页第2版第0次修改第 8 章批准人：年 月 日审核人：年 月 日人精子染色体荧光原位杂交（fish）标准操作规程一. 目 的：建立双三色fish，研究人精子染色体的非整倍体，以及染色体倒位、易位患者所产生配子的情况。二. 实验材料：(一). 实验具器：有刻度离心管、吸管、载玻片、盖玻片、6个立式染缸、小镊子、胶水、玻璃笔。(二). 仪器设备：恒温箱、水平离心机、斜式离心机、荧光显微镜、相差生物显微镜，恒温水浴箱、变性杂交仪（vysis公司） 。(三). 试剂及配制：1. 试剂和

2、药品：美国vysis公司的染色体计数探针（chromosome enumeration probe cep）、20ssc(32-804850)500g、np-40(32-804818)21000ul 生理盐水、 6mm edta的pbs、 dapicounterstain(32-804831)2500ul(125ng/ml)、 无水洒精（100% ethanol）、1n naoh 、纯水（distilled water，h2o）。2. 试剂和药品的配制：1) 20ssc溶液：132g 20ssc加入400ml蒸馏水（h2o）中，混匀，然后加蒸馏水至总量500ml。调节ph5.3，室温保存。有效

3、期为6个月。2) 2ssc溶液：850mlh2o中加入100ml 20ssc，混匀，然后加入h2o至总量1000ml。调节ph7.00.2，室温保存。有效期为6个月。3) 2ssc/0.1%np-40溶液：850ml h2o加入20ml 20ssc溶液，混匀，再加入1mlnp-40，然后加h2o至总量1000 ml。调节ph7.00.2，室温保存。有效期为6个月。4) 0.4ssc/0.3 %np-40溶液：950ml h2o加入20ml 20ssc，混匀，再加入3mlnp-40，然后加入h2o至总量1000ml。调节hp7.0-7.5 ，室温保存。有效期为6个月。三. 操作步骤：1. 标本的

4、准备1) 取材：患者（或自愿献精者）排精后禁欲3-7天，以手淫法将精液收集在洁净的干燥取精杯中，按who的标准化精液分析法进行常规精液分析。2) 洗涤精子：取1ml已液化的精液置于1.5ml的ep管中，以2000rpm/min离心5min，弃上清，用6mm edta的pbs混均， 2000rpm/min离心5min，弃上清。根据情况可重复洗涤23次，以便于去除精浆及杂质。3) 固定：加入1ml 新鲜固定剂（甲醇：乙酸3：1），室温5min，2000rpm/min离心5min，弃上清。反复固定共2次，最后用固定剂重悬，使精子的密度为10-20106精子/ml。4) 滴片：取密度为10-20106

5、精子/ml悬液滴片，37恒温箱烘干。5) 去凝聚：把标本片放置于1n naoh的染缸10分钟，然后蒸馏水冲洗，室温晾干。在相差显微镜下观察，以处理后的精子头膨胀大小为处理前的1.5倍为好。6) 系列酒精脱水：标本置于2ssc溶液中，室温2min；接着置于系列洒精（70%，85%，100%）中脱水各2min。空气晾干。2. 探针的准备：采用雅培vysis公司的探针，cep x spectrum green(绿色荧光fitc）、cep y spectrum orange(橙色荧光texas red）、cep 18 spectrum aqua(浅蓝色荧光aqua)，buffer杂交液。以cepx:

6、cepy: cep18:buffer=1:1:1:7 的比例配制探针混合液10ul，备用。3. 吸取10ul探针混合液加在已做好标记杂交区域，盖上盖玻片，用橡胶胶水封片，待干。注意封片时避免气泡产生，以免影响探针与标本杂交。4. 变性/杂交：将把标本片置于变性/杂交仪上，变性75,3分钟，杂交42,4小时或过夜。5. 洗脱：去除盖玻片与封胶后，将标本片置于75 的0.4%ssc/0.3乙二苯基聚乙二醇（nonidet p-40）2分钟，然后置于室温下的2ssc/0.1% np-40中1分钟，洗脱非特异性杂交。6. dapi复染： 吸取10ul dapi（4，6-diamidino-2-plenylindole）加在杂交区域上，盖上盖玻片，室温放置10分钟。7. 荧光显微镜观察：在配备有green/orange/aqua/dapi四个滤光器的荧光显微镜下阅片。四