生物技术制药[2]

1、生物技术制药2第四章第四章抗体制药抗体制药生物技术制药2本章主要内容本章主要内容l第一节第一节 概述概述l第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体l第三节第三节 鼠源性单克隆抗体的改造鼠源性单克隆抗体的改造l第四节第四节 基因工程抗体和抗体工程基因工程抗体和抗体工程l第五节第五节 抗体诊断药物抗体诊断药物l第六节第六节 抗体治疗药物抗体治疗药物生物技术制药2第一节第一节 概述概述l抗体是能与相应抗原特异性结合的具有抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白免疫功能的球蛋白。l它是机体免疫系统受到抗原物质刺激后，它是机体免疫系统受到抗原物质刺激后，B B淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，淋巴

2、细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。由浆细胞合成和分泌的球蛋白。生物技术制药2血清蛋白分为白蛋白、甲种血清蛋白分为白蛋白、甲种()球蛋白、乙种球蛋白、乙种()球蛋白和丙种球蛋白和丙种()球蛋白球蛋白抗体活性存在于抗体活性存在于丙种球蛋白丙种球蛋白组分组分.将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白蛋白统称为免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)Ig结构结构生物技术制药2Ig结构结构可变区可变区恒定区恒定区异种抗原性异种抗原性生物技术制药2l由于病原微生物是具有多种抗原决定由于病原微生物是具有多种抗原决定簇的

3、抗原物质，因此这些抗体制剂也簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，称为是多种抗体的混合物，称为多克隆抗多克隆抗体体，即针对多种抗原决定簇的抗体。，即针对多种抗原决定簇的抗体。它们在应用过程中经常会出现非特异它们在应用过程中经常会出现非特异性交叉反应。性交叉反应。生物技术制药2第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体l单克隆抗体单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。这种抗体是针对

4、一个抗原决定簇的抗这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是由单一的体，又是由单一的B B淋巴细胞克隆产生淋巴细胞克隆产生的，的，故称为单克隆抗体故称为单克隆抗体。生物技术制药2单克隆抗体和多克隆抗体单克隆抗体和多克隆抗体生物技术制药2免疫学知识免疫学知识: :l人体和动物都有免疫系统，包括特异人体和动物都有免疫系统，包括特异性免疫和非特异性免疫。性免疫和非特异性免疫。生物技术制药2l宿主的屏障宿主的屏障; ;l吞噬细胞吞噬细胞; ;l正常组织和体液中的抗菌物质正常组织和体液中的抗菌物质; ;l炎症反应炎症反应. .非特异性免疫非特异性免疫生物技术制药2l皮肤皮肤; ;l黏膜黏膜; ;l血脑屏障

5、血脑屏障：由介于血循环与脑实质间的软由介于血循环与脑实质间的软脑膜、脉络丛的脑毛细血管壁和包于壁外脑膜、脉络丛的脑毛细血管壁和包于壁外的胶质膜所组成，能阻挡病原生物和其他的胶质膜所组成，能阻挡病原生物和其他大分子物质由血循环进入脑组织和脑室。大分子物质由血循环进入脑组织和脑室。 ; ;l血胎屏障血胎屏障：由介于胎盘和母体血循环之间由介于胎盘和母体血循环之间的子宫内膜基蜕膜和胎儿的绒毛膜滋养层的子宫内膜基蜕膜和胎儿的绒毛膜滋养层细胞所组成，可阻挡母体内有害物质进入细胞所组成，可阻挡母体内有害物质进入胎儿体内胎儿体内 。生物技术制药2生物技术制药2抗原性物质抗原被分解包涵体溶菌酶进入包涵体抗原碎片

6、吞噬作用生物技术制药2l不直接杀死病原体，但能配合免疫细不直接杀死病原体，但能配合免疫细胞、抗体或其他防御因子使它们发挥胞、抗体或其他防御因子使它们发挥较强的免疫功能，如补体、干扰素。较强的免疫功能，如补体、干扰素。生物技术制药2l存在于红细胞、白细胞和血小板等细存在于红细胞、白细胞和血小板等细胞和组织中的组胺和胞和组织中的组胺和5-5-羟色胺在机体羟色胺在机体感染病原体而引起炎症反应时，可使感染病原体而引起炎症反应时，可使炎症部位的毛细血管迅速扩张，血流炎症部位的毛细血管迅速扩张，血流量增加，毛细血管通透性增强，大量量增加，毛细血管通透性增强，大量淋巴细胞从毛细血管穿越进入炎症区。淋巴细胞从

7、毛细血管穿越进入炎症区。生物技术制药2l特异性免疫：当机体受到抗原刺激时，特异性免疫：当机体受到抗原刺激时，体内的抗原特异性淋巴细胞识别抗原，体内的抗原特异性淋巴细胞识别抗原，然后被活化，发生一系列的增殖和分然后被活化，发生一系列的增殖和分化等变化，最终表现出一定的细胞免化等变化，最终表现出一定的细胞免疫或体液免疫。疫或体液免疫。l特异性免疫又分为特异性免疫又分为体液免疫和细胞免体液免疫和细胞免疫疫。生物技术制药2l细胞免疫细胞免疫主要是指机体受到异己物质抗原主要是指机体受到异己物质抗原的刺激后，一类小淋巴细胞的刺激后，一类小淋巴细胞依赖胸腺的依赖胸腺的T T细胞发生增生，分化，直接攻击靶细胞

8、细胞发生增生，分化，直接攻击靶细胞或间接地释放一些淋巴因子从而使机体达或间接地释放一些淋巴因子从而使机体达到免疫的过程。到免疫的过程。生物技术制药2l体液免疫体液免疫是当机体受到抗原刺激后，是当机体受到抗原刺激后，来源于骨髓的小淋巴细胞来源于骨髓的小淋巴细胞BB淋巴细胞淋巴细胞进行增生和分化为浆细胞，进而合成进行增生和分化为浆细胞，进而合成各种免疫球蛋白（抗体），然后在体各种免疫球蛋白（抗体），然后在体液中发挥免疫作用的过程。液中发挥免疫作用的过程。生物技术制药2第三节第三节 鼠源性单克隆抗体的改造鼠源性单克隆抗体的改造l最初制备的单克隆抗体都是鼠源性的，最初制备的单克隆抗体都是鼠源性的，大量

9、应用于人体时可产生人抗鼠抗体，大量应用于人体时可产生人抗鼠抗体，使其作用和效果都受到严重影响，甚使其作用和效果都受到严重影响，甚至有毒副作用。至有毒副作用。生物技术制药2Ig结构结构可变区可变区恒定区恒定区异种抗原性异种抗原性生物技术制药2改造目的改造目的l改造鼠源性单克隆抗体的目的有两个：改造鼠源性单克隆抗体的目的有两个：l1 1、一是降低免疫原性；、一是降低免疫原性；l2 2、二是降低相对分子量，增加组织穿、二是降低相对分子量，增加组织穿透能力。透能力。生物技术制药2一、人一、人- -鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体l抗体同抗原结合的功能抗体同抗原结合的功能取决于抗体分取决于抗体分子的子的可变区，同种

10、性免疫原性可变区，同种性免疫原性则决定则决定于抗体分子的于抗体分子的稳定区。稳定区。l人人- -鼠嵌合抗体：鼠源性单克隆抗体的鼠嵌合抗体：鼠源性单克隆抗体的可变区基因和人免疫球蛋白的稳定区可变区基因和人免疫球蛋白的稳定区基因连接起来，再共转染骨髓瘤细胞，基因连接起来，再共转染骨髓瘤细胞，就可表达出完整的人就可表达出完整的人- -鼠嵌合抗体。鼠嵌合抗体。生物技术制药2二、改形抗体二、改形抗体l用鼠源性单克隆抗体的互补决定区序用鼠源性单克隆抗体的互补决定区序列替换人免疫球蛋白分子中的互补决列替换人免疫球蛋白分子中的互补决定区序列，则可使人的免疫球蛋白分定区序列，则可使人的免疫球蛋白分子具有鼠源性单

11、克隆抗体的抗原结合子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。由于抗体分子中鼠源部分只特异性。由于抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。占很小比例，可基本消除免疫原性。最大最大问题问题是抗体的亲和力下降，甚至是抗体的亲和力下降，甚至丧失活性。丧失活性。生物技术制药2三、小分子抗体三、小分子抗体l基因工程的小分子抗体仅表达鼠源性单基因工程的小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的可变区，其相对分子量仅为克隆抗体的可变区，其相对分子量仅为原抗体的八十分之一到三分之一。原抗体的八十分之一到三分之一。生物技术制药2正在研制的小分子抗体正在研制的小分子抗体l1 1、FabFab片段抗体，由完整的轻链

12、片段抗体，由完整的轻链L L和重链的和重链的可变区加部分恒定区可变区加部分恒定区(V(VH H+C+CH1H1) )；l2 2、FVFV抗体，抗体，V VH H和和V VL L组成；组成；l3 3、单链抗体（、单链抗体（SCFVSCFV），由），由 V VH H和和V VL L 通过一通过一段连接肽连接而成的重组蛋白；段连接肽连接而成的重组蛋白；l4 4、单域抗体，由重链的或轻链的单个可变、单域抗体，由重链的或轻链的单个可变区（区（ V VH H或或V VL L ）组成；）组成；l5 5、最小识别单位，由互补决定区构成。、最小识别单位，由互补决定区构成。生物技术制药2生物技术制药2生物技术制药

13、2单链抗体的优点单链抗体的优点 l1 1、分子小，容易渗透到组织中（包括分子小，容易渗透到组织中（包括肿瘤），增加有效药物浓度；肿瘤），增加有效药物浓度； l2 2、单链易于进行分子改造，如与毒素单链易于进行分子改造，如与毒素拼接；拼接；l3 3、免疫原性小，体内半衰期、免疫原性小，体内半衰期短。短。 l缺点：稳定性较低；功能单一；亲和缺点：稳定性较低；功能单一；亲和力低，稳定性差，体内清除过快。力低，稳定性差，体内清除过快。生物技术制药2四、双功能抗体四、双功能抗体l就是双特异性单链抗体：将抗就是双特异性单链抗体：将抗A抗原抗抗原抗体的轻链可变区体的轻链可变区(VLA)与抗与抗B抗原抗体抗原

14、抗体的轻链可变区的轻链可变区(VLB) 通过短肽连接构成通过短肽连接构成的双链抗体。的双链抗体。l结合抗原的两个臂具有不同的特异性。结合抗原的两个臂具有不同的特异性。生物技术制药2双功能抗体的优点双功能抗体的优点 l一个臂识别肿瘤细胞表面抗原一个臂识别肿瘤细胞表面抗原，包括，包括肿瘤相关抗原、癌基因产物、特殊的肿瘤相关抗原、癌基因产物、特殊的白细胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特白细胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特异性受体等，并有效结合；异性受体等，并有效结合；另一个臂另一个臂可识别免疫效应细胞及分子可识别免疫效应细胞及分子, ,如如CD3CD3(T(T细细胞识别抗原的单位）胞识别抗原的单位）、毒素、药

15、物等。、毒素、药物等。 生物技术制药2五、抗体融合蛋白五、抗体融合蛋白l构建抗体融合蛋白的原则：将第一个蛋构建抗体融合蛋白的原则：将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因的共表达。个基因的共表达。l抗体酶，酶抗体酶，酶- -抗体型融合蛋白，在药物抗体型融合蛋白，在药物治疗中有广阔的前景，它可在靶向位置治疗中有广阔的前景，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，从而上将前体药物转化成有效的药物，从而避免了对正常组织的损害。避免了对正常组织的损害。生物技术制药2第四节第四节 基因工程

16、抗体和抗体工程基因工程抗体和抗体工程l抗体研究的三大阶段：多克隆抗体；抗体研究的三大阶段：多克隆抗体；单克隆抗体；以基因工程方法制备抗单克隆抗体；以基因工程方法制备抗体。体。l基因工程抗体基因工程抗体：不用人工免疫动物和：不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能利用基因制备人源性抗体，而且还能利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动物、植物大规模生产抗体。基因动物、植物大规模生产抗体。生物技术制药2l1 1、获取目的基因：、获取目的基因：RNARNA反转录反转录PCRPCR获取抗获取抗体某一

17、特定基因区段；体某一特定基因区段；l2 2、载体：噬菌粒；、载体：噬菌粒；l3 3、淘筛：抗原固相化后，对噬菌粒群吸附、淘筛：抗原固相化后，对噬菌粒群吸附、洗涤和洗脱，再感染扩增，如此反复；洗涤和洗脱，再感染扩增，如此反复；l4 4、表达与鉴定：鉴定目的基因，导入感受、表达与鉴定：鉴定目的基因，导入感受态菌株，表达态菌株，表达 原核细胞、真核细胞、转原核细胞、真核细胞、转基因植物和基因植物和 动物等表达方式。动物等表达方式。生物技术制药2基因工程抗体的表达基因工程抗体的表达l原核生物原核生物 融合表达和分泌表达融合表达和分泌表达l真核生物真核生物 都是分泌表达都是分泌表达l转基因植物转基因植物

18、 烟草烟草l转基因动物转基因动物 单基因水平。单基因水平。生物技术制药2第五节第五节 抗体诊断药物抗体诊断药物l抗原和抗体的特异性结合在体内和体抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可呈现某种反应。外都可呈现某种反应。在体外可发生在体外可发生凝集或沉淀等反应，可用已知抗体来凝集或沉淀等反应，可用已知抗体来鉴定抗原，作病原学的鉴定抗原，作病原学的诊断诊断和血型测和血型测定，称为血清学鉴定。定，称为血清学鉴定。l在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故可治疗，吞噬或中和毒素等作用，故可治疗，即抗体即抗体治疗治疗药物。药物。生物技术制药2三大类抗体诊断药

19、物：三大类抗体诊断药物：l一、血清学鉴定用的抗体试剂一、血清学鉴定用的抗体试剂l二、免疫标记用的抗体试剂二、免疫标记用的抗体试剂l三、体内导向诊断药物三、体内导向诊断药物生物技术制药2一、血清学鉴定用的抗体试剂一、血清学鉴定用的抗体试剂l血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定，常用凝集反应。的诊断和血型鉴定，常用凝集反应。生物技术制药21 1、鉴定病原菌的抗体试剂、鉴定病原菌的抗体试剂l（1 1）常用品种和用途）常用品种和用途：l诊断血清、分群血清、分型血清、因诊断血清、分群血清、分型血清

20、、因子血清等。子血清等。l（2 2）诊断血清的制备）诊断血清的制备：制备细菌抗原，：制备细菌抗原，免疫动物和制备抗体血清。免疫动物和制备抗体血清。l（3 3）诊断方法）诊断方法：直接凝集反应。：直接凝集反应。生物技术制药22 2、乙型肝炎病毒表面抗原（、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAgHBsAg）的反向被动血凝诊断试剂的反向被动血凝诊断试剂l制备方法，红细胞经甲醛处理后，在制备方法，红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗乙肝病毒血清吸附其上时便具有抗抗乙肝病毒血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中有乙型肝炎病体活性，若待测样品中有乙型肝炎病

21、毒表面抗原时，则发生特异性结合反毒表面抗原时，则发生特异性结合反应而使血细胞发生凝集。应而使血细胞发生凝集。生物技术制药23 3、抗抗ABOABO血型系统血清血型系统血清lABOABO血型抗血清的制备：血型抗血清的制备：l人源性人源性ABOABO血型抗血清是采集健康献血血型抗血清是采集健康献血人的血液，凝固后，置人的血液，凝固后，置4 4度过夜，使冷度过夜，使冷抗体吸附在血块上抗体吸附在血块上, ,分离血清制备抗体。分离血清制备抗体。生物技术制药2生物技术制药2二、免疫标记用的抗体试剂二、免疫标记用的抗体试剂l放射性、荧光或酶标记后将抗原和抗放射性、荧光或酶标记后将抗原和抗体反应放大，提高反应

22、的敏感性，可体反应放大，提高反应的敏感性，可对微量抗原物质进行定性或定量检测。对微量抗原物质进行定性或定量检测。结合显微技术，可定位测定。结合显微技术，可定位测定。生物技术制药2l1 1、荧光抗体诊断试剂、荧光抗体诊断试剂l用荧光色素标记抗体，当抗原与抗用荧光色素标记抗体，当抗原与抗体反应时可发光。体反应时可发光。生物技术制药2生物技术制药2l2 2、免疫酶抗体诊断试剂、免疫酶抗体诊断试剂l用酶标记抗体来检测抗原，有免疫酶用酶标记抗体来检测抗原，有免疫酶染法和酶免疫测定。染法和酶免疫测定。生物技术制药2生物技术制药2l3 3、放射免疫用抗体诊断试剂、放射免疫用抗体诊断试剂l把放射性核素分析的高度灵敏度与抗把放射性核素分析的高度灵敏度与抗原抗体反应的特异性结合。原抗体反应的特异性结合。生物技术制药2生物技术制药2三、体内导向诊断药物三、体内导向诊断药物l以抗体为载体的导向诊断药物的研究比以抗体为载体的导向诊断药物的研究比导向治疗更接近临床应用阶段。导向治疗更接近临床应用阶段。l放射性免疫显像的优点：在体内有确切放射性免疫显像的优点：在体内有确切定位肿瘤的作用；在体内可检出定位肿瘤的作用；在体内可检出0.50.5厘厘米大小的病灶；小分子抗体容易到达肿