病原菌分离培养总结

1、病原菌的分离培养方法一、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。 为了获得 某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同， 而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑 制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量抱子的病原真菌的分 离。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分 离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。二. 病原真菌的分离培养(花生褐斑病为例)

2、1. 分离的准备工作(1) 分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。(2) 培 养基 的准备：PDA培 养基, 加热熔化，紫外灭菌后倒板；(3) 分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、 解剖刀、镊子、接种铲(针)、70%酒精、0. 1%升汞、酒精灯、火机、记号 笔、橡皮筋套、可调式电炉等。(升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心)。2. 组织分离法(1) 工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用 70%酒精擦拭双手；在使用 无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。(2) 酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火

3、焰周围无菌环 境；(3) 取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病 斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。(选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。 腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。)(4) 表面消毒： 用菌培养皿一次准备流程 (75%酒精0.1%升汞无菌水 无菌水 无菌水)，将病组织放人 70酒精中浸 35s 后，按无菌 操作法将病组织移人 01升汞液中分别表面消毒 1 min 左右(如植 物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些) ，然后放入灭菌 水中连续漂洗三

4、次，除去残留的消毒剂。(5) 用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放 3-5 块。(在将 病组织小块移放到平板表面之前， 应将其在无菌吸水纸上吸去多余的 水，以大大减少病组织附近出现细菌污染) 。(6) 将培养皿倒置放人25 C左右恒温箱内培养。一般34d后观察待分 离菌生长结果； 若病组织小块上均长出较为一致的菌落， 则多半为要 分离的病原菌。( 7) 除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外， 还要在显微 镜下检查，并且根据保湿培养的结果进一步确定；(8)在无菌条件下，用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上，在25 C左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即

5、得 该分离病菌纯菌种，便可保存。三 病原细菌的分离培养(萝卜黑腐病为例)1. 分离的准备工作(1) 分离材料准备： 萝卜黑腐病俗称黑心、 烂心，该病是由细菌引起的病害。 主要危害叶和根。幼苗期发病子叶呈水浸状，根髓变黑腐烂。叶片发病，叶缘多 处产生黄色斑，后变V字形向内发展，叶脉变黑呈网纹状，逐渐整叶变黄干枯。 病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展， 最后使全株叶片变黄枯死。 萝卜肉质 根受浸染后，透过日光可看到暗灰色病变；横切萝卜可看到 维管束呈放射线状 、 黑褐 色；重者呈干缩空洞， 维管束溢出菌脓， 这一点与缺硼引起的生理性变黑不 同。(2) 培养基的准备：PDA，后划线纯化NB ;(

6、3)分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解 剖刀、镊子、 70酒精、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。2.黑腐病菌分离(1) 工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用 70酒精擦拭双手；在使用无 菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。(2) 酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌 环境；(3) 取萝卜黑腐病块茎，用 75 %酒精进行表面消毒；用灭菌解剖刀切去表 面，并向内切取病组织，切成长条小块( 2mm*3mm )，用无菌操作法将病组织 移至平板培养基上，每皿内放 3-5 块。(在将病组织小块移放到平板表面之前， 应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以

7、大大减少病组织附近出现细菌污染) 。(4) 将培养皿倒置放人28 C左右恒温箱内培养。一般 34d后观察待分 离菌生长结果； 若病组织小块上均长出较为一致的菌落， 则多半为要分离的病原 菌。( 5)根据菌落的一致性初步确定长出的菌落，选择长出的三种菌落(黄、 红、生防)，分别在无菌条件下在NB培养基进行划线；在28C左右恒温箱内培 养，数经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致， 并与典型描述的特征相一致 时，即表明已获得纯培养；最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。( 6)观察到的菌落特征：萝卜黑腐病菌，圆形，同心环状，内环呈金黄色， 外围白色菌脓，湿润，随环隆起、凹陷，半透明，边缘不

8、整齐。四资料查询其他分离培养方法1. 病原真菌稀释分离法(1) 取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及 分离人姓名。(2) 用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入 0. 51. 0ml。(3) 用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第 一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。(4) 将熔化开冷却到 4550C 的培养基，分别倒在三个培养皿中 (为防止细菌 污染，也可以向每个培养皿中事先加入 1-2滴25乳酸)，摇匀，凝固，要使培 养基与稀释的菌液充分混匀。提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好， 过热易将病原菌烫死而使分

9、离 失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板， 而成为起伏不平的表面， 不利于分 离。为大体估计培养基温度， 可将盛培养基的器皿靠在人手背上， 如果手背感到 烫但尚可以忍耐，则大体为 4550C。(5) 将培养皿翻转后置恒温箱(25C)中培养，数日后观察菌落生长情况。(6) 挑菌。将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培 养基上，置25C左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂， 就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。2. 病原细菌 病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之 前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断， 即经过镜检确认有喷菌现

10、象以后， 才对该病组织作分离工作。 稀释分离法是最经典的标准分离法， 方法同上述真菌 分离。除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1) 预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放 在 30C 恒温箱中 24h ，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2) 将病组织先用0. 1%升汞表面消毒0. 5-2min，再用无菌水换洗3次后, 放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡2060mi n,让细菌释放到灭菌水中。(3) 用灭菌的接种铒 (接种环 )蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线， 尽量 不要把平板表面划破。 划过第一批线后的接

11、种环应放在火焰上烧灼. 冷却后直接 在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要， 这样做可 以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。(4) 用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在2628C恒温箱中培养。1 3d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单 菌落生长出来 ?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。(5) 仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落 用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离， 经培养后出现的菌落在形态特征都趋 于一致，并与典型描述的特征相一致时， 即表明已获得纯

12、培养。 最好要经过连续 三次单菌落的分离，才能确保纯化。五 常用的几种典型的病原菌分离方法1斑点病原菌的分离。从病斑部分切取每边 35mm 的小块组织，在 70酒 精中浸数秒钟后，移人0. 1 %的升汞水溶液中处理3 5rain,以灭菌水冲洗3 次，移置培养皿的培养基中，然后培养。2. 维管束组织内病原菌的分离。从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主 病部表面用 70%酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其 中小块变色的维管束组织， 用升汞或漂白粉液消毒后， 用灭菌水冲洗几次， 移置 培养基面上。3. 根腐病病原菌的分离。根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料 小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。4. 肉质组织中病原菌的分离。多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组 织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用 “直 接接种 ”法，待出现症状后，用此法再行分离。