放线菌新种分类鉴定ppt课件

1、放线菌新种分别鉴定放线菌新种分别鉴定1实验目的实验目的2实验方法实验方法3实验结果实验结果4总结总结2021/12/281;1、实验目的、实验目的2021/12/282 本实验经过对分别得到的放线菌新种从形状学、生理生化反响特征、和分子遗传分类学方面进展鉴定，证明其是以前从未发现的新种。;2、实验方法、实验方法2.1 分别方法分别方法2.3 鉴定方法鉴定方法表观特征表观特征化学分类化学分类基因型分类基因型分类2021/12/2832.2 16SrRNA基因序列测定基因序列测定;2.1 分别方法分别方法2021/12/284近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液相结合的分别方法、再水化近年来出现了胞外

2、多糖胶与动孢溶液相结合的分别方法、再水化-离心离心 法、极高频辐射法、噬菌体定向分别法和蔗糖梯度离心法等用法、极高频辐射法、噬菌体定向分别法和蔗糖梯度离心法等用于稀有放线菌选择性分别的方法。于稀有放线菌选择性分别的方法。;2021/12/2852.2 16SrRNA基因序列测定基因序列测定放线菌基因组的提取放线菌基因组的提取16SrRNA16SrRNA基因扩增基因扩增胶回收胶回收衔接衔接转化转化测序研讨测序研讨;A电镜察看电镜察看B培育特征培育特征C生理生化特征生理生化特征2021/12/2862.3.1 表观特征表观特征;A. 电镜电镜取菌体后取菌体后,3%戊二醛固定戊二醛固定4h, 0.1

3、M磷酸缓冲液漂洗。磷酸缓冲液漂洗。酒精梯度脱水，在酒精梯度脱水，在30%、50、70、80%、100依次脱依次脱水，其中水，其中100酒精酒精2次，每次次，每次10min。 乙酸异戊脂置换，乙酸异戊脂置换，50%一次，一次，100%两次。两次。Eiko公司公司XD-1型二氧化碳临界点枯燥器枯燥，型二氧化碳临界点枯燥器枯燥，Eiko公司公司IB-3型离子镀金仪喷金镀膜。型离子镀金仪喷金镀膜。 JEOL公司公司JSM-840扫描电镜察看。扫描电镜察看。2021/12/287;B. 培育特征培育特征参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培育特征描画参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培育特征描画所采用的规范培

4、育基进展培育特征测定。所采用的规范培育基进展培育特征测定。所用培育基有所用培育基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏琼脂、察氏琼脂、马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂，平板接种，马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂，平板接种，28培育培育7，14，21，28d后分别察看并记录基内菌丝、气生菌丝的后分别察看并记录基内菌丝、气生菌丝的生长情况及可溶性色素。生长情况及可溶性色素。2021/12/288;C. 生理生化实验生理生化实验生理生化特性的测定主要包括生理生化特性的测定主要包括:pH、盐浓度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，脲、盐浓度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，脲酶的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐复

5、原，酶的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐复原，H2S的产生，的产生，黑色素的产生，独一碳、氮源利用等实验。黑色素的产生，独一碳、氮源利用等实验。2021/12/289;a. pH、盐浓度和温度耐受性、盐浓度和温度耐受性upH耐受实验耐受实验u在高氏一号培育基中分别参与在高氏一号培育基中分别参与pH缓冲液，空白培育基作阴缓冲液，空白培育基作阴性对照，性对照，28培育，每周察看一次，周围终了，反复培育，每周察看一次，周围终了，反复2次。次。u温度耐受实验温度耐受实验u将菌株接种在高氏一号培育基上，分别在将菌株接种在高氏一号培育基上，分别在4、10 、16 、20 、28、37、45培育，每周察看一次，

6、周围培育，每周察看一次，周围终了，反复终了，反复2次。次。u盐耐受实验盐耐受实验u高氏一号培育基内参与不同浓度的高氏一号培育基内参与不同浓度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，15%，20%)28培育，每周察看一次，周围终了，反培育，每周察看一次，周围终了，反复复2次。次。2021/12/2810;b. 明胶液化明胶液化取明胶培育基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白取明胶培育基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白对照。于对照。于28C培育箱中培育。培育箱中培育。培育培育2、7、10、14和和30天的试管，放入天的试管，放入4C冰箱或置于冰箱或置于冷水中冷水中30min，然后进展察看。

7、，然后进展察看。如明胶凝块部分或全部变为可流通的液体，那么明胶水如明胶凝块部分或全部变为可流通的液体，那么明胶水解阳性。解阳性。如明胶凝块呈固体，那么明胶水解阴性。如明胶凝块呈固体，那么明胶水解阴性。假设菌体未生长，能够是不能在明胶培育基上生长。假设菌体未生长，能够是不能在明胶培育基上生长。2021/12/2811;c. 淀粉水解淀粉水解将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时，将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时，在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。滴加碘液后培育皿背景呈蓝黑色滴加碘液后培育皿背景呈蓝黑色,菌落周围假设不变菌落周

8、围假设不变色，或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培育基仍不色，或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培育基仍不变色，表示淀粉水解阴性；假设变成透明无色那么为变色，表示淀粉水解阴性；假设变成透明无色那么为阳性，阐明产生淀粉酶水解淀粉。阳性，阐明产生淀粉酶水解淀粉。2021/12/2812;d. 脲酶的产生脲酶的产生e. 牛奶凝固与胨化牛奶凝固与胨化将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，察看牛奶凝固与将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，察看牛奶凝固与胨化景象。胨化景象。假设牛奶有凝块那么为凝固，继续培育，凝固后有假设牛奶有凝块那么为凝固，继续培育，凝固后有液体出现，进一步水解成液体，那么为胨化，普通液体出现，进一步水解

9、成液体，那么为胨化，普通先凝固后胨化。先凝固后胨化。有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培育基变个分子的氨，使培育基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，由于不论底物尿素能否存为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，由于不论底物尿素能否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为为7.0。挑取挑取1824h待试菌培育物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，待试菌培育物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培育培育14d察看结果，如为阴性应继续培育一下，作最终断定，变为粉红察看结果，如为阴性应继续培育一下，作

10、最终断定，变为粉红色为阳性。色为阳性。2021/12/2813;将待测菌种接在硝酸盐液体培育基中，置室温下培育，将待测菌种接在硝酸盐液体培育基中，置室温下培育，1、3、5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。培育液中参与格里氏试剂培育液中参与格里氏试剂A、B液各一滴，如呈现粉红色、液各一滴，如呈现粉红色、玫瑰红色，阐明硝酸盐复原阳性，如无红色出现，那么加玫瑰红色，阐明硝酸盐复原阳性，如无红色出现，那么加1，2滴二苯胺试剂，如呈蓝色，表示培育液中仍有硝酸盐存在，滴二苯胺试剂，如呈蓝色，表示培育液中仍有硝酸盐存在，硝酸盐复原属阴性，假设不呈蓝色，表示硝酸盐和

11、亚硝酸硝酸盐复原属阴性，假设不呈蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸盐都已复原成其他物质，仍按阳性结果处置。盐都已复原成其他物质，仍按阳性结果处置。f. 硝酸盐复原实验硝酸盐复原实验2021/12/2814;g. H2S的产生的产生某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢气体，假设于培育基中参与柠酸而产生硫化氢气体，假设于培育基中参与柠檬酸铁铵或醋酸铵，那么与硫化氢作用生成硫檬酸铁铵或醋酸铵，那么与硫化氢作用生成硫化亚铁或硫化铅黑色沉淀。化亚铁或硫化铅黑色沉淀。h. 黑色素的产生黑色素的产生将供试菌株接种在酪氨酸培育基斜面管上，培将供试菌株接种在酪氨酸

12、培育基斜面管上，培育育 7 d 和和 14 d 察看结果，培育基被染成褐色或察看结果，培育基被染成褐色或者黑色即阐明该菌产生黑色素。者黑色即阐明该菌产生黑色素。2021/12/2815;i. 碳源利用和氮源利用本实验利用碳源利用和氮源利用本实验利用BIOLOG板板碳源：碳源：D-葡萄糖，蔗糖，葡萄糖，蔗糖，L-树胶醛糖，树胶醛糖，D-果糖，果糖，D-木糖，鼠李糖，木糖，鼠李糖，I-肌醇，棉子糖，肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纤维素。甘露醇，纤维素。不加碳源的根底培育基作为阴性对照。不加碳源的根底培育基作为阴性对照。氮源氮源: KNO3，NaNO2，尿素，尿素， (NH4)2SO4，丝氨酸，烟酰胺，

13、酪氨酸，丝氨酸，烟酰胺，酪氨酸， DL-天冬氨酸，天冬氨酸，L-甲硫氨酸，甲硫氨酸，DL-丙氨酸，丙氨酸，L-精氨酸，精氨酸，L(+)-谷氨酸，甘氨谷氨酸，甘氨酸，酸，L-苯丙氨酸，腺嘌呤。苯丙氨酸，腺嘌呤。不同氮源按不同氮源按0.5%的浓度参与，培的浓度参与，培15天后，将各种氮源上的生长情况天后，将各种氮源上的生长情况与不加氮源的根底培育基上的生长情况作比较。与不加氮源的根底培育基上的生长情况作比较。2021/12/2816;A细胞壁化学组分细胞壁化学组分B磷酸类脂测定磷酸类脂测定C甲基萘醌测定甲基萘醌测定D脂肪酸测定脂肪酸测定2021/12/28172.3.2 化学分类化学分类;A.细胞

14、壁化学组分细胞壁化学组分放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖分子中肽链第分子中肽链第3位氨基酸的种类，种间肽桥和临近的位氨基酸的种类，种间肽桥和临近的四肽交联的位置来决议放线菌细胞壁型的划分。四肽交联的位置来决议放线菌细胞壁型的划分。Lechevalier等等1976根据放线菌细胞壁的化学组根据放线菌细胞壁的化学组分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为9个主要类群个主要类群和和4个糖型。个糖型。2021/12/2818;胞壁类型胞壁类型主要组成主要组成代表属代表属IL,L-DAP，甘氨酸，甘氨酸Sterptomyce

15、sIIMeso-DAP，甘氨酸，甘氨酸MicromonosporaIIIMeso-DAPActinomaduraIVMeso-DAP，阿拉伯糖，半乳糖，阿拉伯糖，半乳糖NocardiaV赖氨酸，鸟氨酸赖氨酸，鸟氨酸ActinomycesVI赖氨酸（天冬氨酸，半乳糖）赖氨酸（天冬氨酸，半乳糖）OerskoviaVIIDAB，甘氨酸，甘氨酸AgromycesVIII鸟氨酸鸟氨酸BifidobacteriumIXMeso-DAP， 多种氨基酸多种氨基酸Mycoplana放线菌细胞壁的主要构成放线菌细胞壁的主要构成Lechevalier，19762021/12/2819;糖类型糖类型主要成分主要成分代

16、表属、种代表属、种A阿拉伯糖，半乳糖阿拉伯糖，半乳糖NocardiaB马杜拉糖马杜拉糖ActinomaduraC无特征性糖无特征性糖StreptomycesD木糖，阿拉伯糖木糖，阿拉伯糖MicromonosporaE半乳糖半乳糖Kutzneria viridogriseum放线菌全细胞的主要糖类型放线菌全细胞的主要糖类型Lechevalier，19762021/12/2820;全细胞全细胞TLC分析实验流程：分析实验流程：全细胞糖分析全细胞糖分析菌体培养与收集菌体培养与收集细胞水解细胞水解（0.1ml 0.5mol/L HCl）点样点样（0.6-0.8l水解液和水解液和1%的的标准糖液）标准糖

17、液）层析层析显色显色（苯胺邻苯二甲酸试剂）（苯胺邻苯二甲酸试剂）氨基酸分析氨基酸分析菌体培养与收集菌体培养与收集细胞水解细胞水解（0.1ml 6mol/L HCl）点样点样（氨基酸水解样品（氨基酸水解样品0.4l和和0.01mol/L标准氨基酸标准氨基酸混合液混合液0.2l）层析层析显色显色（0.4%茚三酮试剂）茚三酮试剂）2021/12/2821;磷酸类脂位于放线菌细胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸类脂磷酸类脂位于放线菌细胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸类脂组份是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类工程中不可组份是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类工程中不可短少的分类指

18、征。磷酸类脂的种类繁多，但用于分类的指征并不多。短少的分类指征。磷酸类脂的种类繁多，但用于分类的指征并不多。用于分类指征的磷酸类脂只需五种：用于分类指征的磷酸类脂只需五种：磷脂酰乙醇胺磷脂酰乙醇胺phosphatidyl ethanolamine,PE磷脂酰甲基乙醇胺磷脂酰甲基乙醇胺phosphatidyl methyl ethanolamine,PME磷脂酰胆碱磷脂酰胆碱phosphatidyl choline, PC磷脂酰甘油磷脂酰甘油phosphatidyl glycerol ,PG含葡萄糖胺的未知构造磷酸类脂含葡萄糖胺的未知构造磷酸类脂phospholipids of unknown

19、structure containing glucosamine, GluNuB. 磷酸类脂测定磷酸类脂测定2021/12/2822;称取称取1g湿菌体于带螺口的湿菌体于带螺口的40 ml离心管中。离心管中。参与参与15ml甲醇。甲醇。100水浴水浴10 min，自然冷却。，自然冷却。 参与参与10 ml氯仿和氯仿和6 ml 0.5%NaCl。 用力摇匀用力摇匀10 min，静止可看到分层。，静止可看到分层。 8000 rpm，离心，离心10 min。到入分液漏斗静止分层，取下层。到入分液漏斗静止分层，取下层。30-40旋转蒸干。旋转蒸干。分两次各参与分两次各参与200l氯仿氯仿/甲醇甲醇2:

20、1冲洗器壁。冲洗器壁。 液体移入液体移入EP管约管约100-200l,8000 rpm，离心，离心10 min，去沉淀。，去沉淀。4保管备用。保管备用。 细胞磷脂的提取细胞磷脂的提取2021/12/2823;点样点样（距离底边距离底边2*2cm，点样，点样10l，溶剂前沿，溶剂前沿1cm）展层展层（展层液：第一层：展层液：第一层： 氯仿氯仿:甲醇甲醇:水水=65:25:4 第二层第二层: 氯仿氯仿:甲醇甲醇:乙酸乙酸:水水=80:12:15:4 ）显色显色（6种显色剂）种显色剂）实验流程：实验流程：2021/12/2824;C. 甲基萘醌测定甲基萘醌测定2021/12/2825大多数细菌含有甲

21、基萘醌或泛醌，或两者均有。包大多数细菌含有甲基萘醌或泛醌，或两者均有。包括放线菌在内的革兰氏阳性细菌只含甲基萘醌。括放线菌在内的革兰氏阳性细菌只含甲基萘醌。放线菌及有冠军的甲基萘醌异戊烯侧链长度和氢饱放线菌及有冠军的甲基萘醌异戊烯侧链长度和氢饱和度变化相当大，多为部分饱和，含有和度变化相当大，多为部分饱和，含有7-12个异戊烯个异戊烯单位。单位。放线菌目中不同菌属的甲基萘醌类型如下表所示。放线菌目中不同菌属的甲基萘醌类型如下表所示。;2021/12/2826放线菌目中甲基萘醌类型放线菌目中甲基萘醌类型类型类型萘醌种类萘醌种类Eubacteria（异戊烯单位无氢化）（异戊烯单位无氢化）IaMK-

22、7Bmk-9Mycobacterium（主要是（主要是8或或9个异戊烯个异戊烯单位上被单位上被2或或4个氢化）个氢化）IIaMK-8(H2)bMK-8(H4)cMK-9(H2)dMK-9(H4)Saccharomonospora（4氢化的多烯萘醌）氢化的多烯萘醌）IIIaMK-8(H4), MK-9(H4)bMK-9(H4),MK-10(H4)Streptomyces（具有同一链长，但氢（具有同一链长，但氢饱和度不同的萘醌）饱和度不同的萘醌）IVaMK-9(H2), MK-9(H4),MK-9(H6)bMK-9(H4), MK-9(H6),MK-9(H8)cMK-10(H4),MK-9(H6)

23、;菌体的搜集制备菌体的搜集制备待测菌株用液体培育基培育，离心搜集菌体，用蒸馏待测菌株用液体培育基培育，离心搜集菌体，用蒸馏水洗涤两次，菌体于水洗涤两次，菌体于-80冷冻冷冻3d，冷冻枯燥机抽干菌，冷冻枯燥机抽干菌体，冻干菌体体，冻干菌体4枯燥器保管备用。枯燥器保管备用。醌的提取及纯化醌的提取及纯化2021/12/2827;D. 脂肪酸测定脂肪酸测定放线菌细胞中脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团具放线菌细胞中脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团具有分类学意义，是一项重要的分类特征。有分类学意义，是一项重要的分类特征。脂肪酸组份普通较为复杂，分别归属脂肪酸组份普通较为复杂，分别归属3种类型：

24、种类型： 直链饱和与不饱和、分枝和复杂方式的脂肪酸。直链饱和与不饱和、分枝和复杂方式的脂肪酸。脂肪酸分析应在规范化的条件下进展，由于不同组分的相对脂肪酸分析应在规范化的条件下进展，由于不同组分的相对含量因菌龄和培育条件的不同而异。含量因菌龄和培育条件的不同而异。脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分析可为种和亚种分类提供有用的根本资料。析可为种和亚种分类提供有用的根本资料。2021/12/2828;2.2.3 基因型分类基因型分类AG+C%含量分析含量分析BDNA-DNA分子杂交分子杂交C16srRNA基因序列分析及进化树的构建

25、基因序列分析及进化树的构建2021/12/2829;A. G+C%含量分析含量分析DNA 碱基组成比例碱基组成比例G+C mol%是非常典型的基因指征之一，是非常典型的基因指征之一，普通以为普通以为 G+C mol%在种内相差不会超越在种内相差不会超越 3%，在属内不会超越，在属内不会超越 10%。大量分析结果阐明：放线菌属于高大量分析结果阐明：放线菌属于高 GC 含量的微生物，并且含量的微生物，并且 G+C%变化范围小，最多不会超越变化范围小，最多不会超越 30%。由于。由于 G+C%在不同物在不同物种中均是比较恒定的，因此可作为诸多分类指征中不可或缺的一种中均是比较恒定的，因此可作为诸多分

26、类指征中不可或缺的一个，经常作为属的分类鉴定规范之一。个，经常作为属的分类鉴定规范之一。2021/12/2830;HPLC实验：实验：2021/12/2831实验条件：实验条件：1.0ml/min 37C柱子：柱子：C18反相柱反相柱溶剂：溶剂：12%甲醇甲醇 20mM磷酸三乙胺磷酸三乙胺pH5.1 20mM磷酸三乙胺磷酸三乙胺pH5.1配制：配制：三乙胺三乙胺99%用水稀释，用用水稀释，用85%磷酸调磷酸调pH至至5.1，即，即0.5M磷酸三乙胺磷酸三乙胺40ml 0.5M磷酸三乙胺磷酸三乙胺pH5.1与与750ml glass-distilled water混合，再混合，再参与参与120mlHPLC-grade甲醇，再参与水至总体积为甲醇，再参与水至总体积为1L。不用柱子时，流速减至不用柱子时，流速减至0.1ml/min当仪器超越当仪器超越3天不运用时，柱子先用水清洗，再用天不运用时，柱子先用水清洗，再用70%甲醇清洗。甲醇清洗。;B. DNA-DNA分子杂交分子杂交DNA-DNA分子杂交可以在基因组程度上研讨微生物间的分子杂交可以在基因组程度上研讨微生物间的区别与联络，用于种程度的分类学研讨和新种确实立。区别与联络