实验讲义-酶制剂生产与应用

1、尼龙固定化木瓜蛋白酶一、目的：了解共价交联法固定酶的原理和步骤二、原理尼龙是聚酰胺物质，经HCI水解后暴露出游离NH2 NH2与戊二醛反应，尼 龙即成活化载体，可与酶表面 NH2反应，把酶连在尼龙上。三、实验材料、仪器和试剂1、材料尼龙布（86或66），140目，剪成3cm 3cm2、仪器（1）恒温水浴锅 （2）紫外分光光度计（3） 冰箱3、试剂（I）18.6%CaCl2 溶液 （2）甲醇溶液（3）3.65mol/LHCI 溶液0.2mol/L 硼酸缓冲液（pH值8.5）（5）5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.50.1mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.8）（7）1mg

2、/mL木瓜蛋白酶溶液（8） 0.5mol/L NaCl 溶液（9）0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH 值 7.2）（10）激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制，含20mmol/L半胱氨酸、 1mmol/LEDTA勺混合液。（II）0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制。（12）10%三氯乙酸（TCA）溶液。四、操作步骤1、固定化酶的制备（1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaC2溶液10s，再浸入18.6% 水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。取出后用水洗涤，用滤纸吸 干。 将尼龙布用3.65mol/L HCI溶液在室

3、温下水解45min,用水洗至pH值中性（pH 试纸检测）。（3）将尼龙布用5戒二醛溶液在室温下浸泡偶联 20min。 取出尼龙布，用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.8）洗涤3次，洗去多余的戊 二醛，吸干之后，加入5ml 1mg/mL的木瓜蛋白酶液，在室温下固定 30mi n。 从酶液中取出尼龙布，用 0.5mol/L NaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。2、酶活力测定A. 0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+1ml酪蛋白液B. 0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+2ml 10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液C. 固定化

4、酶一张（剪碎）+2.0ml激活剂+1ml酪蛋白液取三支试管按上述加入反应液，37C反应15min, A C+2ml 10%E氯乙酸。三支试管过滤上清液到另三支试管中，以B管作空白，测试管A、C吸光值（280nm 紫外）五、结果计算1.酶活定义：每15min增加0.001个消光值所需酶量为1个酶活单位。固定化酶活52. 酶活回收=100%溶液酶活x5/0.2六、注意事项（1）尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。（2）固定化酶溶液浓度最好为0.51mg/mL对每块尼龙布用量不宜超过 0.8mL。（3）酶活性测定的反应时间一定要准确。实验二、有机溶济沉淀法制备大豆脲酶

5、及其活力测定（4课时）实验类型：综合性实验目的：掌握酶的提取与性质测定中的实验方法，熟悉有关酶提取与活力测定的基本 原理和基本操作。实验内容：1. 提取：（1）称取约5g人造浮石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡1-2分钟， 倾去酸，用蒸馏水洗涤至中性，沥干备用。（2）称取约10g新鲜大豆粉，置于锥 形瓶中，加上述人造浮石，加 50ml32%5酮溶液，在冰浴中持续摇动 45min, 4 层纱布过滤，收集滤液。（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加 10ml32%9酮，再 提取一次。纱布过滤，滤液在 4C, 3500r/min下离心810min,倾出上清液， 计量体积。取1mL酶液保存，供测酶活力用。2.

6、 沉淀酶：（1）将提取的酶液置冰浴中缓慢搅拌下，用滴管逐滴滴加 2%昔 酸，并不断用精密pH试纸检测pH变化，观察产生混浊现象，至pH4.9左右。置 4C 10分钟。（2） 4C3500r/min离心10min,沉淀用电吹风稍微吹干，所得即为（人-A,）标准管中的NH3微摩尔数（A2-A） 5min酶样品毫升数脲酶粗品。称重，计算酶收得率。3. 脲酶的活力测定：脲酶的活力测定利用脲酶催化尿素水解成氨和二氧化 碳，氨与纳氏试剂反应生成黄色化合物， 吸光度与氨年度成正比，可测定脲酶活 力大小。实验要求：提取大豆脲酶，并进行收得率和脲酶的活力测定，结果计算：1）提取制备脲酶的收得率：酶收得率 酶干重

7、+酶干重x测酶活留取液体体积/酶液总体积100% 酶得率（）=样品重2）脲酶活力测定：式中：n为酶样品的稀释倍数试管号 步骤123（1）酶液（mL原液或适当稀释）001.00（2）标准硫酸铵溶液（mL）00.300（3）蒸馏水（mL）2.001.701.00(4) 10%-三氯乙酸(mL)1.001.000（5）室温平衡5 min。实验三酸性磷酸酯酶的提取和酶活力测定一、实验目的1.掌握胞内酶的分离提取方法；(6) 3%尿素(mL)1.001.001.00（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5 min，立即向样品管（31管）加10%E氯乙酸1.00mL终止反应。各管摇匀后，取1.0 ml溶液

8、置于EP管中，室温、10,000rpm离心5 min，吸取0.2 ml上清按步骤（8）进仃反应。（8）另取3支洁净的试管，分别对应于上述各管，进行后续反应。反应液（mL）0.200.200.20蒸馏水（mL4.304.304.30奈氏试剂（mL0.500.500.50（9）各管混匀后30 min内，用分光光度计 F1800测试：比色记录A480nmA1A2A3脲酶活力（U/ml）2 掌握酸性磷酸酯酶的活力测定方法。二、实验原理酸性磷酸酯酶存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一 性的水解磷酸单酯键。本实验以绿豆芽为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠 经酸性磷酸酯酶作用，可水解生成

9、酚和无机磷。当有足量底物磷酸苯二钠存在时， 酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的 定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1卩mol产物所需要的酶量为1个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷 酸酯酶的活力。三、试剂与器材1 器材高速离心机，托盘天平，滴管，漏斗，纱布若干，滤纸若干，研钵一套，培 养皿一个，100mL量筒1支，可见分光光度计，恒温水浴锅，5mL 1mL移液管各 一支，试管20支，试管架一支。2材料绿豆芽(当日采摘，50g )3 试剂(1) 酸性磷酸酯酶液取原酶液用0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液稀释1

10、0-20倍。(2) 5mmol/L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)精确称取磷酸苯二钠2.54g，加蒸馏水溶解后定容不得至100mL即配成为 100mmol/L磷酸二苯钠水溶液，密闭保存备用。用 0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓 冲液稀释20倍，即得5mmol/L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)。(3) 0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液(4) Folin-酚试剂于200mL磨口回流装置内加入钨酸钠 100g、钼酸钠25g、水700mL 85%磷 酸50mL以及浓盐酸100mL微火回流10h后加入硫酸锂150g、蒸馏水50mL和溴 数滴摇匀。煮沸约15mi n,以驱残溴，溶液呈黄色，轻微带绿色

11、；如仍呈绿色， 如重复加液体溴的步骤。冷却定容到 1000mL过滤，置于棕色瓶中可长期保存， 使用前，用蒸馏水稀释3倍。(5) 1mol/L碳酸钠溶液(6) 0.4mmol/L酚标准溶液精确称取分析纯的酚结晶0.94g溶于0.1mmol/L盐酸溶液中，定容至1000mL即为酚标准贮存液，储存于冰箱中可永久保存，此时酚浓度约为 0.01mol/L 0使用前将上述的酚标准贮存液用蒸馏水稀释 25倍，即得到0.4mmol/L 酚标准溶液。四、操作步骤1 酸性磷酸酯酶的提取(1) 材料处理将绿豆芽掐去根和叶得绿豆芽茎，称取50g的绿豆芽茎，在研钵中彻底研碎， 室温静置30min,在培养皿中用双层纱布挤

12、滤，得到滤液。(2) 离心将滤液移至2支离心管中，平衡后放入离心机中，以4000r/min的速度离心 20mi n。(3) 酶液回收将离心管中大部分上清液转移至量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸 过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后转移至三角瓶中，做好标记，用塑料薄 膜密闭，作为“原酶液”在冰箱中保存备用。2 酸性磷酸酯酶酶活力的测定(1)标准曲线的制作取试管6支，编号，空白为0号，按照下表操作。以0号试管为空白，在可见分光光度计上680nm波长处读取各管的吸光度A*。，以A*。作为横坐标，酚标准溶液的体积(mL为纵坐标作一标准曲线，此曲线应是一条直线0123450.4mmol/L酚标准溶

13、液(ml)00.0.20.30.0.5140.2mol/L、pH5.6乙酸盐缓冲液(mL10.0.80.70.0.5961mol/L碳酸钠溶液(mL)55.5.05.05.5.0.0003.酶促反应的加样顺序要正确,否则无法显色。 沁园春雪Folin-酚试剂（mL）0.50.50.50.50.50.5摇匀，35 C保温显色10min以上A680 值0（2）酶活力测定取2支试管，按下表编号和操作1 号试管0 号试管5mmol/L磷酸苯二钠溶液（mL）0. 50. 535 C预热 2min酶液（35 C预热过的，ml），加入就计时0.50精确反应10min,加入1mol/L碳酸钠溶液5mLFolin-酚稀溶液（mL0.50.50号试管加入酶液0.5mL摇匀，35 C保温显色10min以上A680 值0用可见分光光度计测1 号试管在680nm处光吸收值A。,注意加样顺序要正 确，否则不能显色。（3）酶活力的计算用1 号试管的A680在标准曲线上查出其在对应的酚标准应用液的体积（V，单位mL，根据公式：酶活力=2X 0.4 X VX 1000/10，可计算出1mL酶液中所含有的酶的活力。五、实验报告试管00 123451 A68000V (mL1mL酶液的