《生物工程专业分析》实验指导书

1、生物工程专业分析实验指导书适用专业： 生物工程 贵州大学二OO七年十二月前 言本实验是针对于生物工程专业分析课程开设的，主要内容是通过实验使学生更好的掌握专业分析课堂授课的内容，更直观的了解各类生物工程样品的分析方法和理论原理。在实验中要求学生熟练掌握分析的基本实验操作技能和方法；对学生进行实际样品的分析测定操作训练，使学生掌握获得正确分析数据的基本过程和基本方法，切实培养他们分析问题和解决问题的能力。要求学生在实验中应用课堂讲授的理论知识，勤于动手、动脑，实验中认真观察记录现象及结果，做好实验报告。具体试验项目有游离氨基酸测定、蛋白质测定、粗脂肪测定、还原糖测定、总酸总酯测定、铜的测定、酶活

2、力测定、阿贝折射仪的使用等。其中蛋白质测定为综合性实验。目 录 1、 实验一：游离氨基氮测定42、实验二：白酒中总酸的测定 63、实验三：白酒中总酯的测定 84、实验四：粗脂肪含量测定105、实验五：淀粉的测定136、实验六：铜含量测定167、实验七：波美计、密度计及阿贝折射仪的使用188、实验八：酶活力测定229、实验九：蛋白质含量测定2510、附件一：实验报告基本内容要求2811、附件二：实验报告格式2912、附件三：实验注意事项30实验 一 ： 游离氨基氮测定 实验学时：3学时实验类型：验证实验要求：必修一、实验目的1、 掌握甲醛法测定游离氨基氮的测定原理和方法。二、实验内容使用甲醛滴定

3、法测定游离氨基氮三、实验原理氨基酸中的NH2基的pK值常在9.0以上，不能和NaOH标准溶液直接滴定。但可以用甲醛法测量。在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸中的a-氨基相互作用，使滴定终点移至pH值9.0左右，可以用酚酞批示剂，以NaOH标准溶液来滴定NH3+基上的H+,每释放一个氢离子，就相当于有一个氨基氮R-NH3+H+R-NH2R-NH2+2HCHOR-N(CH2H)2滴定的结果表示游离a氨基的含量，其精确度可达理论量的90%。如果样品中只某一种已知的氨基酸，从甲醛法结果可求得该氨基酸的含量。如果样品中是多种氨基酸的混合物(如蛋白水解液)，则测定结果不能作为氨基酸的定量依据。一般常

4、用此法测定蛋白质水解程度，随着水解程度的增加滴定值增加，当水解完全后，滴定值即保持恒定。甲醛滴定法采用的甲醛浓度为2.0-3.0mol/L，即滴定后最终浓度为6 %-9 %。四、实验组织运行要求集中授课形式五、实验条件1试剂(1)40中性甲醛溶液: 在50mL 36 % 37 %甲醛中加入5滴5g/L酚酞乙醇溶液，然后用0.2mol/L NaOH溶液滴定到微红(使用前需重新中和)(2)酚酞指示剂: 5g/L酚酞的50%乙醇溶液(3)0.01mol/L氢氧化钠标准溶液(4)10%(体积分数)乙酸溶液2玻璃仪器50ml容量瓶20ml移液管碱式滴定管50ml量杯250ml三角瓶六、实验步骤(1)样品

5、处理 称取试样0.2g(准确至1mg)，置入研钵中，加5ml 10%乙酸溶液研磨至均匀，用水转移到50mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀、过滤(弃去最初部份溶液)。(2)样品滴定 在三角瓶中加入2mL样品滤液，加水4mL，3滴酚酞指示剂，摇匀后用0.01mol/L NaOH标准溶液滴定到微红色。然后加入2mL中性甲醛溶液，摇匀，放置片刻，再用0.01mol/L NaOH标准溶液滴定回到微红色中点，记下甲醛加入后样品消耗NaOH标准溶液的体积。同样，取6mL水按以上操作做空白实验。七、计算a-氨基氮含量(%)=(V-V0)c0.014(1/2)50(1/m)100式中： V加甲醛后样品消耗NaOH标

6、准溶液体积(mL)V0加甲醛后空白消耗NaOH标准溶液体积(mL)cNaOH标准溶液的浓度(mol/L)0.014消耗1ml 1mol/L NaOH标准溶液相当于氮的质量(g)2吸取样品滤液的体积(mL)50样品稀释液的总体积(mL)m称取试样质量(g)八、讨论(1)甲醛法中除氨态氮外别的氮也能起反应(如铵盐、酰胺等)，故误差较大。另外由于各种氨基酸的等电点不同，故确定一个合适的滴定终点较为困难。(2)脯氨酸与甲醛作用后，生成不稳定化合物，致使滴定结果偏低，酪氨酸含有酚基，滴定时要消耗一定的碱，可使滴定结果偏高。溶液中若有氨存在也可与甲醛反应，使结果偏高。九、思考题 若溶液中有铵存在测定结果会

7、偏高还是偏低十、实验报告实验预习、实验记录和实验报告具体要求详见附件一和附件二。实验 二 ： 白酒中总酸含量测定 实验学时：2学时实验类型：验证实验要求：必修一、实验目的1、掌握酸碱滴定法测定白酒中总酸度的原理及方法二、实验内容白酒中的总酸用标准碱溶液直接滴定，根据所消耗的碱量推算出白酒中总酸的含量。三、实验原理白酒中的总酸以中和法直接测定，根据所消耗的碱液量计算出白酒中总酸的含量（白酒中总酸以乙酸计）四、实验组织运行要求采用集中授课形式。五、实验条件1试剂：(1)5g/L酚酞指示剂(2)0.1mol/L氢氧化钠溶液2仪器：(1)50ml碱式滴定管(2)50ml移液管(3)250ml三角瓶(4

8、)50ml量杯六、实验步骤准确吸取50ml白酒样品，置入250ml三角瓶中，加50ml水和2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色。记录滴定体积。同时做空白试验。七：计算： 总酸（以乙酸计g/100ml）=（VV0）C0.06006100/50式中：V滴定样品时消耗氢氧化钠溶液的量mlV0滴定空白时消耗氢氧化钠溶液的量mlC氢氧化钠溶液摩尔浓度mol/L0.06006每毫升氢氧化钠相当于乙酸的毫克数50吸取白酒样品体积ml八、实验报告实验预习、实验记录和实验报告具体要求详见附件一和附件二。实验 三 ： 白酒中总酯含量测定 实验学时：2学时实验类型：验证实验要求：必修一、实验目

9、的1、 掌握酸碱滴定法测定白酒中总脂的原理及方法二、实验内容白酒中的总脂的测定是先用碱中和游离酸，再加一定量的碱使酯皂化，过量的碱用酸滴定。三、实验原理先用碱中和白酒中的游离酸，再加一定量的碱使酯皂化，过量的碱用酸滴定。四、实验组织运行要求采用集中授课形式。五、实验条件1试剂:(1)5g/L酚酞指示剂(2)0.1mol/L氢氧化钠溶液(3)0.1mol/L盐酸溶液2仪器;(1)50ml碱式滴定管(2)50ml酸式滴定管(3)50ml移液管(4)250ml三角瓶(5)50ml量杯六、实验步骤准确吸取50ml白酒样品，置入250ml三角瓶中，加50ml水和2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠

10、溶液滴定至微红色（不可过量）。再准确加入25.0ml 0.1mol/L氢氧化钠溶液，放置过夜皂化（或接上回流冷凝器，于沸水浴中回流皂化半小时），用0.1mol/L 盐酸溶液滴定至红色刚刚消失。记录盐酸溶液用量体积。七、计算： 总酯（以乙酸乙酯计g/100ml）=（C1V1C2V2）0.08812100/50式中：V1氢氧化钠溶液的量mlV2滴定样品时消耗盐酸溶液的量mlC1氢氧化钠溶液摩尔浓度mol/LC2盐酸溶液摩尔浓度mol/L0.08812每毫升盐酸相当于乙酸乙酯的毫克数50吸取白酒样品体积ml八、思考题： 第一次用氢氧化钠滴定的目的是什么？九、实验报告实验预习、实验记录和实验报告具体要

11、求详见附件一和附件二。实验 四 ： 粗脂肪含量测定 实验学时：6学时实验类型：验证实验要求：必修一、实验目的1、 了解索氏抽提器的构造2、 掌握索氏抽提法测定样品中粗脂肪的原理及方法二、实验内容样品用无水乙醚或石油醚等溶剂抽提出，蒸出溶剂所得的物质，称为粗脂肪。三、实验原理本法为重量法，用脂肪溶剂将脂肪提出后进行称量，该法适用于固体和液体样品。通常将样品浸于脂肪溶剂，为乙醚或沸点30至60的石油醚，借助于索氏提取器进行循环抽提。用本法提取的脂肪性物质为脂肪类物质的混合物，其中含有脂肪、游离脂肪酸、磷脂、酯、固醇、芳香油及某些色素等。因此，称为粗脂肪。四、实验组织运行要求采用集中授课形式。五、实

12、验条件1试剂:(1)无水乙醚或石油醚（沸程30至60）2：仪器：(1)索氏提取器(2)恒温水浴锅(3)烘箱(4)脱脂棉花(5)滤纸(6)分析天平六、实验步骤1：样品预处理：称取样品的重量根据材料中脂肪的含量而定,通常脂肪含量在10以下的，称取样品10-12克；脂肪含量为50-60的，则称取样品2-4克，(可以用测定水分后的样品)。将样品在80-100烘箱去水分。一般烘4小时，烘干时要避免过热。冷却后，准确地称取一定量样品，必要时，拌以精制海砂，无损地移入滤纸筒内，用脱脂棉塞严，将滤纸筒放人索氏提取器的提取管内，注意勿使滤纸筒高于提取管的虹吸部分。2：抽取： 将洗净的提取瓶在105烘箱内烘干至恒

13、重,加乙醚约达到提取瓶容积的1/22/3，然后将提取器各部分连接，注意不能漏气。加热提取时，应在电热恒温水浴中进行(水浴温度约为40-50)，严禁用火焰直接加热索氏提取器。在加热时乙醚蒸发，乙醚蒸汽由连接管上升至冷凝器，凝结成液体滴入提取管中，此时样品内的脂肪为乙醚液面超过虹吸管高度后溶有脂肪的乙醚虹吸管流入提取瓶，循环抽提，调解水浴温度，使乙醚每小时循环35次，抽提时间视样品的性质而定，一般需612小时，样品含有脂肪是否提取完全，可以用滤纸来粗略判断，从提取管内吸取少量的乙醚并滴在净的滤纸上，待乙醚干后，滤纸上不留有油脂的半点则表示已经提取完全。提取完全后，再将乙醚蒸到提取管内，待乙醚液面达

14、到虹吸管的最高处以前，取下提取管。3：称重和计算：将提取瓶中的乙醚全部蒸干，洗净外壁，置于105烘箱干燥至恒重，按下式计算样品的粗脂肪百分含量。 粗脂肪含量(%)=(m2-m1)100/m 式中： m称取试样质量(g) m1抽提瓶质量(g) m2抽提瓶与粗脂肪质量(g)七：讨论(1)乙醚易燃(BP：34.6)，在抽提、蒸发或蒸馏回收时，切忌明火加热。(2)试样需干燥，否则有机溶液不易渗透，使结果偏低。试样粉碎度以过40目筛为宜。颗粒大太试样，脂肪不易抽提完全，颗粒太小试样，易透过滤纸筒，使抽提物增重。(3)有机溶剂应无水，否则试样中碳水化合物及无机物易被抽提，使结果偏高。(4)脂肪含量较低的试

15、样，由于抽提质量与粗脂肪质量差太大，测定结果误差较大。此时可以采用称重抽滤前后试样滤纸筒，求得粗脂肪含量（抽提前后的试样滤纸筒，都应于(1052)烘干后称重）。（5）放入滤纸筒的高度不能超过回流弯管，否则乙醚不易穿透样品，脂肪不能全部提出，造成误差。（6）碰到含多量糖及糊精的样品，要先以冷水处理，等其干燥后联同滤纸一起放入提取器内。（7）提取时水浴温度不能过高，一般使乙醚刚开始沸腾即可（约45左右）。回流速度以每8-12次时为宜。 (8)冷凝管上端最好连接一个氯化钙干燥管，这样不仅可以防止空气中水分进入，而且还可以避免乙醚挥发在空气中，这样可防止实验室微小环境空气的污染。如无此装置，塞一团干脱

16、脂棉球亦可。(9)如果没有无水乙醚可以自己制备，制备方法如下：在1000毫升乙醚中，加入无水石膏50克，振摇数次，静置1 0小时以上蒸馏，收集35以下的馏液，即可应用。(10)将提取瓶放在烘箱内干燥时，瓶口向一侧倾斜45放置使挥发物乙醚易与空气形成对流，这样干燥迅速。(11)样品及醚提出物在烘箱内烘干时间不要过长，因为一些很不饱和的脂肪酸，容易在加热过程中被氧化成不溶于乙醚的物质；中等不饱和脂肪酸，受热容易被氧化而增加重量在没有真空干燥箱的条件下，可以在100-105干燥1.5-3小时。八、思考题1采用无水乙醚作提取剂时，若样品未经过干燥，测定结果会怎样？2索氏抽提法是否对所有的样品都适用？九

17、、实验报告实验预习、实验记录和实验报告具体要求详见附件一和附件二。实验 五 ： 还原糖的测定实验学时：4学时实验类型：验证实验要求：必修一、实验目的1、 掌握费林法测糖的原理及方法二、实验内容费林法测定还原糖的原理和方法。三、实验原理碱性酒石酸钾钠甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用还原糖滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，进而与亚铁氰化钾反应生成可溶性的浅黄色亚铁氰化钾铜络合物。待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖次甲基蓝还原，溶液蓝色消失，即为滴定终点

18、。根据样液的消耗量可计算出还原糖含量。四、实验组织运行要求采用集中授课形式。五、实验条件1试剂：(1)碱性酒石酸铜甲液：称取15克硫酸铜(CuSO4.5H20)及0.05克次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000毫升(2)碱性酒石酸铜乙液:称取50克酒石酸钾钠及75克氢氧化钠，溶于水中，再加入4克亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000毫升，贮于橡胶塞玻璃瓶内(3)1g/L转化糖标准溶液(4)200g/L氢氧化钠溶液(5)6mol/L盐酸溶液(6)乙酸锌溶液:称取21.9g乙酸锌，加3ml冰醋酸，加水溶解并稀释到100ml。 (7)106g/L亚铁氰化钾溶液2.仪器：(1)50ml酸式滴定管(2)

19、 5ml、10ml、25ml、50ml、100ml移液管 (3)250ml三角瓶(4)250ml容量瓶(5)25ml量杯(6)恒温水浴锅六、实验步骤1样品处理(1)乳类、乳制品及含蛋白质的饮料 称取2.55.0g固体样品或吸取2550mL液体样品，置于250mL容量瓶中，加50mL水，摇匀后慢慢加入5mL乙酸锌及5mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置0.5h。用干燥滤纸过滤，收集滤液供测使用。(2)酒精性饮料 吸取100mL样品于蒸发皿中，用1mol/L NaOH中和至中性，在沸水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250mL容量瓶中，加50mL水混匀，以后按(1)操作。(3)含多量淀粉的食

20、品 称取1020g样品，置于250mL容量瓶中，加200mL水，在45水浴中加热1h.振摇。取出冷却后加水至刻度，混匀，静置。吸取20mL上清液于另一250mL容量瓶中，以后按(1)操作。(4)汽水等含CO2饮料 吸取100mL样品于蒸发皿中，在沸水浴中除去CO2，移入250mL容量瓶，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶，加水至刻度，混合后备用。2碱性酒石酸铜溶液标定 吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中。加水10mL，从滴定管加约9mL标准转化糖，使其在2min内加热沸腾。准确沸腾30s，微沸下以每2秒1滴的速度继续滴加转化糖标液，直至溶液蓝色刚好褪去为滴定终点，后滴

21、定操作需在1min内完成，消耗糖液在1mL以内。记录消耗转化糖标液的总体积。计算：10mL(甲、乙液各5mL)碱性酒石酸铜溶液，相当于转化糖的质量(mg)： F=V式中 F10mL碱性酒石酸铜溶液，相当于转化糖的质量(mg) 转化糖标准溶液的浓度(mg/mL) V标定时消耗转化糖标准溶液的总体积3(1)样品溶液预测定：吸取碱性酒石酸铜甲乙溶液各5.0mL，置于250mL锥形瓶中，加水10ml，使其在2min内加热沸腾，准确沸腾30s，微沸下以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，待溶液蓝色变浅时，以每2秒1滴的速度继续滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为滴定终点，记录样品溶液消耗体积。(2)样品溶液精

22、测定：吸取碱性酒石酸铜甲乙溶液各5.0mL，置于250mL锥形瓶中，加水10ml，从滴定管加入比预测时样品溶液消耗总体积少1ml的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，微沸下以每2秒1滴的速度继续滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为滴定终点，记录样品溶液消耗总体积。七、计算： 还原糖含量(以葡萄糖计，%)=(m/V)250(1/m)(1/1000)100式中： m10mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg) V测定时消耗样品溶液的体积(mL)； 250样品溶液的总体积(mL)； m称取试样质量(g)。注：含多糖淀粉食品试样还需乘以250/20。八、讨论：(1)此法所用的氧化剂碱性酒

23、石酸铜的氧化能力较强，醛糖和酮糖都可以被氧化，所以测得的是总还原糖量。(2)碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使实际有效浓度降低。(3)滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防空气进入反应液中。九、思考题1本法能够用硫酸铜作澄清剂？2滴定时为什么要在保持在沸腾状态下？3样品溶液预滴定的目的是什么？4碱性酒石酸铜甲液和乙液为什么要分别储存？5滴定过程中为什么要严格控制反应条件？十、实验报告实验预习、实验记录和实验报告具体要求详见附件一和附件二。实验 六 ： 铜含量测定 实验学时：3学时实验类型：

24、验证实验要求：选修一、实验目的1、 掌握DDTC法测定铜含量的原理及方法2、 掌握分光光度计的使用二、实验内容DDTC比色法测定铜含量三、实验原理 铜离子在碱性溶液中与二乙基二硫代氨基甲酸钠（DDTC）生成橙黄色络合物，经四氯化碳萃取，比色法测定。四、实验组织运行要求采用集中授课形式。五、实验条件1试剂: （1）铜标准溶液：准确称取1g金属铜，分次加入稀硝酸（2+3）溶解，总量不超过37mL，用水稀释定容至1000mL，每1mL含铜1mg。使用时用0.5%稀硝酸到1mL含铜10g （2）柠檬酸铵EDTA溶液：20g柠檬酸铵，5%EDTANa22H2O，溶于水并稀释至100ML（3）1g/L铜试

25、剂：二乙基二代硫代氨基甲酸钠，(C2H5)2NCS2Na3H2O (4)1g/L酚红指示剂(5)四氯化碳(6)1+17硫酸溶液(7)11氨水2仪器：(1)分析天平(2)721分光光度计(3)5ml刻度移液管(4)25ml容量瓶(5)25ml量筒六、实验步骤1.样品处理：a、试样灰化分解 取2g试样，置入瓷坩埚中，于电炉上加热炭化至无焰，置入马弗炉中，于500600灰化至白色，加2mL（1+1）HCL及5mL水，煮沸，用水定容至25Ml。b、试样湿法消化 取2g试样，置入高型硬质烧杯中，加520mL浓硝酸，盖上表面皿，浸泡过夜。于电炉上微火加热至熔化，冷却，加510mL浓硝酸，加热。如溶液仍有棕

26、红色炭化趋势，则再加浓硝酸，加热消化，直至溶液透明为止，继续加热至溶液冒溜之浓厚白烟，并出现粉红色或黄白色残渣，冷却，用水定容至25mL。2标准曲线的绘制 在6只125mL分液漏斗中，分别加入0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL铜标准溶液（10g/mL），加硫酸（1+17）至约20mL，加5mL柠檬酸铵EDTA溶液，3滴1g/L酚红指示剂，用氨水（1+1）调至红色（pH9），加2mL 1g/L铜试剂，10mL四氯化碳，强烈振摇萃取2min，静置分层，取下层氯仿层比色，波长440nm，1cm比色皿，测定吸光度，绘制标准曲线。七：计算 铜含量（mg/kg）=251000 式中： 由试样吸

27、光度从标准曲线查得铜的质量（g） V吸取试剂体积（mL） 25试液总体积（mL） m称取试样质量（g）八：讨论（1）柠檬酸铵与EDTA络合物，掩蔽Fe、Al、Cr、Mn等离子的干扰。（2）酚红指示剂变色范围pH6.88.4，pH6.8时呈红色，pH6.88.4呈黄色，pH8.4呈红色，在用氨水调节前溶液呈酸性红色，加氨水后应调至由红变黄再变为碱性红色。若改成百里酚酞（麝香草酚酞），变色范围pH9.410.6，pH10呈无色，pH10呈蓝色，用氨水调节从无色变为蓝色为止。（3）铜离子还可以在酸性条件（pH2），用吡啶偶氮间苯二酚（PAR）显色，生成棕红色络合物，直接比色测定。九、思考题：加入柠檬

28、酸铵EDTA络合剂的作用是什么？十、实验报告实验预习、实验记录和实验报告具体要求详见附件一和附件二。实验 七 ： 波美计、酒精计及阿贝折射仪的使用 实验学时：2学时实验类型：验证实验要求：必修一、实验目的1、 掌握用波美计测定糖液比重方法2、 掌握用酒精计测定酒精度方法3、 掌握用阿贝折射仪测定糖液折射率的方法二、实验内容用波美计糖液的波美度，酒精计测定白酒的酒精度，用阿贝折射仪测定糖液的折射率及浓度。三、实验原理（1）波美计、酒精计都属于密度计，是根据阿基米德原理制成的。波美计是以波美度（Be）来表示液体浓度大小的；酒精计的刻度表示溶液内酒精的体积百分含量。（2）阿贝折光仪：光线在阿贝折光仪

29、内进行的情况如图所示。ABC和EFD是进光棱晶和折射棱晶的纵剖面图，C、D为90，B、E为60，其间是厚约0.15mm的样液薄层。当光线L由进光棱晶I点射入到达AB液面时，由于被测样液的折射率不同，将有一部分光反射或全反射。若旋转棱晶使ION等于临界角临，即产生全反射，则所有入射角小于临界角的光线（即图中临界线IO左方的光线及与它们平行的光线）可折射进入样液层，然后通过折光棱晶投影到物镜K上，物镜把一组组平行光束（S、S、S及U、U、U等）汇集于视野XY，呈现光亮；所有入射角大于临界角的光线（即图中临界线IO右方的光线及与它们平行的光线）发生全反射不能进入样液层，因而也不能达到视野XY，故呈现

30、黑暗。由此在视野中便出现了明暗两部分。由于样液的浓度不同，折射率不同，故临界角的大小也不同，又因折射率与临界角成正比，故在刻度尺上直接刻上折射率或锤度值。当旋转棱晶调节旋钮使视野内明暗分界线恰好通过十字线交点时，表示光线从棱晶射入样液的入射角达到了临界角，此时即可从读数镜筒中读取样液的折射率或锤度值。附图1：阿贝折光仪构造图1.测量镜筒 2.阿米西棱镜手轮3.恒温器接头 4.温度计5.测量棱镜 6.铰链7.辅助棱镜 8.加样品孔9.反射镜 10.读数镜筒11.转轴 12.刻度盘罩13.棱镜锁紧扳手 14.底座四、实验组织运行要求采用集中授课形式。五、实验条件1试剂： (1)酱油 (2) 白酒

31、(3)糖液2：仪器：(1)波美计(2)酒精计(3)阿贝折光仪六、实验步骤1波美计、酒精计的使用：将被测样液沿壁徐徐倒入适当容积的清洁量筒中，避免起泡沫。将密度计洗净擦干，缓缓放入样液中，待其静止后，再轻轻按下少许，然后待其自然上升，静止并无气泡冒出后，从水平位置读取与液面相交处的刻度值。同时测量样液的温度，如不是20，应加以校正。2阿贝折光仪的使用： 分开两棱晶，以脱脂棉球蘸取乙醇擦净，挥发干乙醇。滴12滴样液于下面棱晶的平面中央，迅速闭合两棱晶，调节反光镜，使两镜筒内视野最亮；由目镜观察，转动棱晶旋钮，使视野出现明暗两部分；转动色散补偿器旋钮，使视野中只有黑白两色；转动棱晶旋钮，使明暗分界线

32、在十字线交叉点上；从读数镜筒中读取折射率或锤度值；测定样液的温度打开棱晶，用蒸馏水、乙醇或乙醚擦净棱晶表面及其他机件。七：讨论(1)测定比重时，玻璃量筒要放在平的实验台或桌面上，使比重计悬在量筒中心，不要碰及四周及底部(2)如果试样颜色深，可取蒸馏液测定(3)酒精度为100mL酒样内含纯酒精的毫升数，为溶液的百分数(V/V%)(4)酒精在使用前和必须洗净和拭干（5）光棱镜必须注意保护，不能在镜面上造成划痕，不能测定强酸、强碱及有腐蚀性的液体，也不能测定对棱镜、保温套之间的粘合剂有溶解性的液体（6）次使用前应洗净镜面；在使用完毕后，也应用丙酮或95%乙醇洗净镜面，待晾干后再关上棱镜（7）在使用或

33、贮藏时均不得曝于日光中，不用时应放入木箱内，木箱置于干燥地方。放入前应注意将金属夹套内的水倒干净，管口要封起来（8）应注意恒温温度是否正确。如欲测准至0.0001，则温度变化应控制在0.1的范围内。若测量精度不要求很高，则可放宽温度范围或不使用恒温水（9）折光仪不能在较高温度下使用；对于易挥发或易吸水样品测量比较困难；对样品的纯度要求较高八、思考题1波美计的刻度方法是怎样的？2色散补偿器的作用是什么？九、实验报告实验预习、实验记录和实验报告具体要求详见附件一和附件二。实验 八 ： 酶活力测定 实验学时：3学时实验类型：验证实验要求：必修一、实验目的1、 掌握糖化酶活力测定的原理及方法二、实验内

34、容淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，采用碘量法测定葡萄糖含量，葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠氧化，过量的碘用Na2S2O3滴定，计算出酶活力。三、实验原理糖化酶广泛分布于能直接以淀粉为营养源的所有生物体中。糖化酶催化淀粉水解，从淀粉分子非还原性末端开始，分解a1，4葡萄糖苷键生成葡萄糖，葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。四、实验组织运行要求采用集中授课形式。五、实验条件1仪器：（1）pH4.6 0.1mol/L HAc缓冲剂： 称取乙酸钠（NaAc3H2O）6.7g溶于水中，加冰乙酸2.6mL，调至pH4.6后用水稀释至100

35、0mL（2）0.05mol/L： Na2S2O35H2O和0.2gNa2CO3用新鲜煮沸过的冷水溶解并稀释至1000mL，配制一周后以碘酸钾（或重铬酸钾）标定（3）0.1mol/L碘溶液 称取36g碘化钾溶于100mL水中，加入14g碘碘逐渐溶解，加3滴盐酸，用水稀释至1000mL, 棕色瓶保存（4）1mol/L硫酸溶液（5）0.1mol/L NaOH溶液（6）20g/L可溶性淀粉溶液（7）200g/L NaOH溶液（8）10g/L 淀粉指示剂2仪器： (1) 50ml酸式滴定管(2) 1ml、2ml、5ml刻度移液管(3)50ml比色管(4)25ml量筒(5)恒温水浴锅六、实验步骤(1）待测

36、酶液的制备：称取酶粉12g，准确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mL），先用少量的乙酸缓冲溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入适当的容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（酶液浓度在样品与空白消耗Na2S2O3的差值为36mL为宜），摇匀。通过四层纱布过滤，滤液供测定用。(2）酶活力测定：于甲、乙两支50mL比色管中，分别加入20g/L可溶性淀粉25mL和pH4.6乙酸缓冲液5ml,摇匀后至40恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2mL，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立即各加200g/L NaOH溶液0.2ml，摇匀。将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2

37、mL。吸取上述反应液各5mL，分别置于碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘溶液10mL，再加0.1mol/L NaOH溶液15mL，摇匀，密塞，于暗处反应15min。取出，加1mol/L硫酸2mL，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。不同稀释倍数，应做相应的空白实验。七、计算:酶活力单位定义：在上述条件（40、pH4.6）下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖为一个酶活力单位。糖化酶活力（u/g或u/mL）=（V1-V2）c90.05n2式中：V1空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（mL） V2样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（mL） cNa2S2O3标准溶液的浓度（mol/

38、L） 90.05与1.0mL 1mol/L Na2S2O3标准溶液相当的以g表示的葡萄糖质量 32.2反应液的总体积（mL） 5吸取反应液的体积（mL） 1/2吸取酶液2.00Ml，以1.00mL计 n酶液稀释倍数 2反应30min，换算成1h的酶活力系数 所得的结果表示至整数八、思考题：为什么甲管和乙管加入酶液的时间不同？九、实验报告实验预习、实验记录和实验报告具体要求详见附件一和附件二。实验 九 ： 蛋白质的测定 实验学时：5学时实验类型：综合实验要求：必修一、实验目的1、 掌握水蒸气蒸馏法测定样品中蛋白质的原理及方法二、实验内容本实验所涉及到的知识点有:采用湿消化法破坏样品中的有机物的方

39、法和操作,蒸馏吸收的原理及方法,总氮含量的凯氏定氮法测定原理性。三、实验原理凯氏定氮法：含蛋白质样品经加硫酸、硫酸钾、硫酸铜等催化剂消化，使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。消化：有机含氮物+H2SO4CO2+SO2+H2O+NH32NH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸馏：(NH4)2SO4+ 2NaOH 2H2O+NaSO4+2 NH3吸收： 2 NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5 H2O滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3B

40、O3四、实验组织运行要求集中授课形式五、实验条件1试剂:(1)浓硫酸过氧化氢水混合液(2:3:1) 在100mL水中缓慢加入浓硫酸200mL，冷却后再加入30% 过氧化氢300mL，混合备用。此溶液存放阴凉处可保存一个月(2)混合指示剂贮备液 取50mL 1g/L溴甲酚绿无水乙醇溶液与200mL甲基红无水乙醇溶液混合,贮于棕色瓶中备用(3)硼酸指示剂混合液 取100mL 20g/L硼酸溶液，滴加指示剂贮备液，摇匀衙溶液呈紫红色即可(4)混合催化剂 硫酸铜(CuSO4.5H2O)10g，硫酸钾100g, 硒0.2g，在研钵中研细，通过40目筛，混匀后备用(5)0.01mol/L标准溶液(6)40

41、0g/L NaOH溶液2玻璃仪器:(1)、凯氏定氮仪(2)、定氮瓶(3)、150ml三角瓶 (4)、50ml、l0ml、100ml量筒(5)、10ml移液管(6)、酸式滴定管(7)、100毫升容量瓶(8)、小漏斗六、实验步骤(1)消化：准确称取试样0.20.3g(含有1030mg粗蛋白质)置入100mL凯氏烧瓶中，加混合催化剂1g，同时加硫酸过氧化氢水混合液35mL，稍加振摇，斜置于电炉上，在通风橱内加热进行了消化。开始用低温加热，勿使瓶中泡沫超过瓶肚的三分之二，待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度保持微沸。消化到溶液呈浅蓝色的透明状时，再继续加热沸腾10min,取出，冷却到室温后，将消化液转入1

42、00mL容量瓶中，用7080mL水洗涤凯氏烧瓶，冷却至室温后加水稀释到刻度，摇匀。同时作一空白，除不加试样外，其它操作相同。(2)蒸馏：在半微量凯氏定氮仪的蒸馏瓶中，加入5mL稀释消化液和10mL水，再加入400g/L NaOH溶液，立即用水蒸气蒸馏，接收三角瓶中加20mL硼酸指示剂混合液。待蒸馏沸腾后蒸馏至溶液呈亮绿色后再蒸馏5min。(3)滴定：用0.01mol/L HCl标准溶液滴定三角瓶中的吸收液，滴定至溶液由亮绿色变成浅紫色为止。吸取5mL空白消化液，按照上述步骤进行操作。七、计算粗蛋白质含量(干基，%)=(V-V0)c0.0140K(1/m)1001/(1-X)式中 V滴定试样时消

43、耗HCl标准溶液体积 V0滴定空白时消耗HCl标准溶液体积 cHCl标准溶液的浓度(mol/L) K氮换算成粗蛋白质的系数，一般取6.25 M称取试样质量(g) X试样水分含量(%) 0.0140消耗1ml 1mol/L HCl标准溶液相当于氮的质量(g)八、讨论(1)凯氏定氮法分常量、半微量和微量三种，其原理和操作步骤基本相同。所不同的是常量法适于测定范围为15-40mg氮，半微量法2-5mg氮，微量法0.05-1 mg氮。另外，碱化后蒸馏，常量法是采用直接蒸馏法，半微量和微量法采用水蒸气蒸馏法。(2)消化过程中，若浓硫酸过氧化氢水混合液损失过多时，可酌量补加，勿使瓶内干涸。消化液加水稀释后，应及时进行蒸馏，否则应保存消化液。临用时加水稀释。(3)蒸馏过程中切忌火力不稳，否则将发生倒吸现象。(4)混合指示剂在pH5.2 时为紫红色，Ph5.6时为亮绿色，变色点为5.4，指示剂变色范围很窄，灵敏度高。（5）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。（6）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。（7）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。（8）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示