圆二色谱仪操作规程培训

1、JASCO J-1500圆二色谱仪操作培训圆二色谱仪操作培训-食品科技学院食品科技学院 中心实验室中心实验室 唐老师唐老师 目 录1、圆二色谱仪基本原理与应用圆二色谱仪基本原理与应用2、 JASCO J-1500 基本组成与附件基本组成与附件3、开机与基本操作规程、开机与基本操作规程4、数据分析、数据分析5、关机与试验注意事项、关机与试验注意事项 1、圆二色谱仪基本原理、圆二色谱仪基本原理平面偏振光平面偏振光的电向量的电向量E E起偏振器起偏振器自然光的自然光的电向量电向量E E椭圆偏振光椭圆偏振光：两束偏振光的振幅两束偏振光的振幅( (强度强度) ) 不相同不相同圆二色性圆二色性(CD)(C

2、D)：活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率差值，将传播：活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率差值，将传播的左右圆偏振光变成椭圆偏振光。的左右圆偏振光变成椭圆偏振光。两束互相垂直，振幅相等的平面偏振光，其位相相差两束互相垂直，振幅相等的平面偏振光，其位相相差1/41/4波长时，合成圆偏振光。波长时，合成圆偏振光。圆二色性圆二色性(CD)(CD)的表示：的表示：CDCD单位转换方法：单位转换方法：/blog/post/circular-dichroism-units-conversion.htmlEllipticity（椭圆率（椭圆率 ）：mdeg，定义单位，仪器测

3、定直接显示CD图y坐标。Mean residue ellipticity or Molar ellipticity (摩尔椭圆率摩尔椭圆率)：单位为deg.cm2.dmol-1，文献中通常都使用根据Beer-Lambert law 有： = . l.c 或 =mdeg/(l.c ) (c-摩尔浓度)计算出的值最后再乘以1000即可转换为deg.cm2.dmol-1对于蛋白质蛋白质，使用的是mean residue ellipticity。由于mean residue molecular weight= protein formula weight/number of residues.摩尔圆二

4、色性为摩尔消光系数的差值（delta epsilon），即： = LCP- RCP在分子模拟中通过高斯理论计算CD光谱时，得到的结果通常是以摩尔圆二色性摩尔圆二色性 表示表示。 与摩尔椭圆率（molar ellipticity）之间的转换：=3298.2 CDCD光谱与光谱与ORDORD光谱光谱：同时产生，包括同样的分子结构信息，光学活性物质分子中的不同时产生，包括同样的分子结构信息，光学活性物质分子中的不对称生色团。对称生色团。CDCD反应光与分子间能量的转换，旋光性则是与分子反应光与分子间能量的转换，旋光性则是与分子中电子的运动有关。中电子的运动有关。差异：差异：CDCD比比ORDORD容

5、易辨别重叠峰，易检测弱吸收带、更容易拟合、容易辨别重叠峰，易检测弱吸收带、更容易拟合、能够提供较多意义明确的信息。能够提供较多意义明确的信息。旋光性旋光性(ORD)(ORD)：光学活性分子对左、右圆偏光的折射率不同，透射：光学活性分子对左、右圆偏光的折射率不同，透射光仍然为平面偏振光，但其旋转了一定的角度（旋光度）。光仍然为平面偏振光，但其旋转了一定的角度（旋光度）。圆二色谱仪应用：圆二色谱仪应用：*蛋白质折叠研究蛋白质折叠研究*蛋白质构象研究蛋白质构象研究*DNA/RNADNA/RNA相互作用相互作用*酶动力学研究酶动力学研究*有机立体化学研究有机立体化学研究*光化学物质纯度检测光化学物质纯

6、度检测*药物量的分析药物量的分析 天然有机化学天然有机化学 生化和大分子生化和大分子 金属复合物化学金属复合物化学 医学医学 农业化学农业化学 物理化学物理化学 快速扫描实验快速扫描实验 通过通过CDCD光谱可用于分析诸如光谱可用于分析诸如核酸、蛋白质、多糖等生物大分核酸、蛋白质、多糖等生物大分子光活性物质子光活性物质的空间结构。的空间结构。蛋白质：蛋白质：氨基酸的圆二色性：氨基酸的圆二色性： 在可见光区没有吸收，紫外区只有在可见光区没有吸收，紫外区只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。2、 JASCO J-1500 基本组成与附件基本组成与附件配置：配置：1）检

7、测器：）检测器： UV-VIS 163-950nm NIR 400-1250nm2) 光源：光源：氙灯氙灯3)气体：高纯气体：高纯N24)多通道多通道测定测定 （CD/HT/Abs），），CD测定范围：测定范围：20, 200, 2000,10000 mdeg5) 蛋白质二级结构蛋白质二级结构分析软件分析软件6)其他其他附件附件：变温支架、停流附件等：变温支架、停流附件等附件附件 1)变温样品支架（变温样品支架（-40130）石英比色皿石英比色皿:1、10mm石英比色皿石英比色皿:1、2、5、10mm附件附件 2) 固体样品支架与积分球检测器固体样品支架与积分球检测器制样工具制样工具可做透射法

8、或反射法，可做透射法或反射法，压片制样或直接上样压片制样或直接上样3) 停流附件停流附件注射器：注射器：10ml单管路死体积：单管路死体积：46ul注射器注射器Flow rateMax :5ml/minMixing Ratio:整数倍整数倍反应动力学检测反应动力学检测 4) N2吹扫装置吹扫装置只能用于标准样品支架，用于只能用于标准样品支架，用于190nm以下样品测试以下样品测试 3、开机与基本操作规程、开机与基本操作规程1）开气开气：打开氮气打开氮气，调节分压在，调节分压在0.02mPa左右，依据测定波长左右，依据测定波长范围在仪器右侧的流量控制器中调节所需的气体流量。范围在仪器右侧的流量控

9、制器中调节所需的气体流量。(190nm 2L/min; 185-190nm 5-10L/min; 2时，测试不准确。适宜的A范围0.6-1。b)控制控制HT范围在范围在170-700之间之间，降低HT方法：降低样品浓度、使用短光程长比色皿、增加带宽、注意溶剂效应。HT700时没有足够的光到达检测器，测试结果不准确。狭缝宽太大，HT170可损坏PMT检测器。4、数据分析、数据分析1）数据类型：）数据类型： 2D数据：数据：.jws格式，光谱分析软件以及二级结构分析软件格式，光谱分析软件以及二级结构分析软件都是需要这种格式数据文件。都是需要这种格式数据文件。 3D数据：数据：.jwb格式，需根据需

10、要提取格式，需根据需要提取2D数据后进行相关分数据后进行相关分析。析。2）蛋白质二级结构软件分析：）蛋白质二级结构软件分析：CD单位需为摩尔浓度，故需已单位需为摩尔浓度，故需已知蛋白浓度（知蛋白浓度（mg/ml），氨基酸残基平均分子量（未知时，），氨基酸残基平均分子量（未知时，一般取一般取110）。）。“蛋白质中20中氨基酸的平均分子质量约为138，但在多数蛋白质中较小的氨基酸占优势，因此平均相对分子质量约为128。又因每形成一个肽键将除去一分子水（相对分子质量18），所以氨基酸残基的平均相对分子质量约为128-18=110。”-王镜岩版生物化学第三版上册p160 2D数据分析：数据分析： 二

11、级结构分析：二级结构分析：打开打开protein Secondary structure estimation软件，打开转换单位后软件，打开转换单位后另存的文件数据另存的文件数据。 3D数据分析：数据分析：需进行需进行2D数据提取后方可进行有关分析。点击数据提取后方可进行有关分析。点击Interval Data Analysis软件，打开软件，打开.jwb格式格式3D数据文件。数据文件。5、关机与测试注意事项、关机与测试注意事项1）关机程序：）关机程序： 关闭软件、关闭电脑和J-1500主机电源、关闭水循环、通气10min后关闭氮气。2）样品架确认：）样品架确认：仪器开机前确认安装的是何种样品支架，若是变温支架必须先开循环水才能开机。3）禁止未开气体开机：）禁止未开气体开机：高