酵母双杂交实验流程

1、模块七 蛋白质之间的相互作用1. 实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料 , 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。 主要介 绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母 双杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的 制备的基本原理和主要的操作步骤。2. 实验原理1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的 认识( 即细胞内基因转 录的起始需要转录激活因子的参与 , 提出并建立了酵母双杂 交系统。该系统作为发现和研究活细胞 体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的 技术平台 , 近几年得到了广泛的运用和发展。相比于其它蛋白质筛选系统 , 酵

2、母双杂交系统具有以下优点 :(1 检测在真核活 细胞内进行 , 在 一定程度上代表细胞内的真实情况。 (2 作用信号是在融合基因表 达后,在细胞内重建转录因子的作 用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 (3 检测结果是基因表达产物的积累效应 , 因而可检测 存在于蛋白质之间的微弱或暂时 的相互作用。 (4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型 和分化时期 材料构建 cDNA 文库, 能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位 及功能蛋白。(5通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、 X-Gal 及 HIS3 蛋白表 达等检测方法均很敏感。酵母双杂交系统也

3、具有一定的局限性。 首先, 经典的双杂交系统分析蛋白间 的相互作用定位于细 胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体 蛋白的研究。 酵母双杂交系统的另一个局 限性是“假阳性” 。在酵母双杂交系 统建立的初期阶段，由于仅仅采用B-半乳糖苷酶这一单一的报告 基因体系，这种 报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制 , 因此容易产生假阳性。由于某些蛋白 本 身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用 , 使 DNA 结合结构 域融合蛋白在无特异 激活结构域的情况下也可被激活转录。 另外某些蛋白表面含 有对多种蛋白质的低亲和力区域 , 能与其 他蛋白形成稳定的复合物 , 从而引起

4、报告 基因的表达 , 产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的 原因可能有许多蛋白质 间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、 磷酸化和二硫键形成 , 还有些蛋白 的 正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告 基因 ADE2、 HIS3、 MEL1/lacZ, 这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性 的GAL4-反应元件和三类启动子元 件-GAL1、GAL2以及MEL1(如图6-1-1 。通 过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融 合蛋白可以直接与GAL4结合 位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性 ;

5、 另一类是融合蛋 白和某种 转录因子结合后再结合到特定的 TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基 因就已经能 够提供较强的营养选择压力 , 这时选择性地使用 HIS3 报告基因 , 一来 可以降低假阳性率 ;二来可以 控制筛选的严格性 (如果需要筛选与诱饵蛋白具有较 强结合的蛋白 ,就可以同时使用 ADE2、 HIS3 两 种报告基因 ; 如果只需要筛选与 诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白,就可以使用ADE2或HIS3两者中的一 种。MEL1和lacZ分别编码a -半乳糖苷酶和 B -半乳糖苷酶,可以作用于相应 的底物X- a -Gal和X- B -Gal使酵母变蓝。其中，a -

6、半乳糖苷酶是外分泌酶，在酵 母表面就能直接检测到；B -半乳糖苷酶是内分泌酶，需要将酵母破碎后才能检测 到。 用蓝斑显示酵母细胞内两个蛋白的相互作用 的方法不仅具有较高的敏感性 , 而且蓝斑的深浅还可以反映两个蛋白相互作用的强弱。随着酵母双杂交系统的广泛应用 , 这一系统得到了不断的完善及改进 , 除了经 典的双杂交系统以 外, 同时也衍生出单杂交系统、三杂交系统、反向酵母双杂交系 统、 hSos/Ras 募集系统 (hSos/Ras recruitment systems 、泛素分裂系统 (Split-ubiquitin systems 、双诱饵系统 (Dual-bait systems 等

7、一 系列相关系 统,根据这些系统的不同特点 ,可以分别应用于蛋白质与 DNA 、 RNA 的相互作用、 蛋白 质复合体之间的相互作用、 膜蛋白质之间的相互作用、 筛选阻断蛋白间相互作用的药物等一系列领域,对经典的酵母双杂交系统起到了很好的补充，并有力 地推动了酵母双杂交系统的发展与应用。酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNA bi ndi ng domai n, DB 和转录激活结构 域（activatio n domai n, AD ,它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的 DB虽然能和

8、启动子结合，但是不能激活转录。 而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。根据转录因子的这一特性，将BD与已知的诱饵蛋白质X融合,构建出BD-X 质粒载体；将AD基因与cDNA文库,基因片段或基因突变体（以丫表 融合,构建 AD-Y质粒载体。两个 穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。 蛋白质X和丫的 相互作用导致了 BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS下游启动子调节的酵 母菌株特定报告基因（如LacZ , HIS 3, LEU 2 等 的表达（图6-1-2 ,使转化体由 于HIS3或LEU2表达，而可在特定的缺陷培养基上生长，同时因LacZ表达而 在 X- a

9、 -Gal存在下显蓝色。酵母双杂交原理示意图3. 实验仪器微量取液器（2卩L; 20卩L; 200卩L; 1,000 卩L、低温离心机、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系 统、蛋白凝胶电泳系统、凝胶成像系统、半干转移系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、无菌接种环、10cm培养皿、15 cm 培养皿。4. 实验试剂(1 裂解缓冲液 (Cracking buffer :尿素 8 mol/LSDS 5 %Tris-HCl (pH 6.8 40 mmol/LEDTA 0.1 mmol/L溴酚蓝 0.4 mg/ml(2 各种基础培养基和营养缺陷培 养基 :minimal SD bas

10、e, minimal SD agar base, YPD medium, YPD agar medium, -Leu DO supplement, -Trp DO supplement, -Leu/-Trp DO supplement, -Leu/-Trp/-His DO supplement, - Leu/-Trp/-His/-Ade DO supplement, 腺苷酸 (adenine , PEG8000, Carring DNA, 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO , TE/LiAC buffur, PEG/LiAC, X-a -gal或 X- B -gal

11、 。(3 酵母质粒提取试剂盒 , LB 培养基,羧苄青霉素和卡那霉素。(4 蛋白标准。(5 Z-buffer (pH7.0 :Na2HPO?4 7H2O 16.1 g/LNaH2PO?4 H2O 5.5 g/LKCI 0.75 g/LMgSO?4 7H2O 0.246 g/L(6 Z-buffer/X- B -Gal 液体 :Z-buffer 100 mlB -巯基乙醇0.27 mlX- B -Gal 储存液 1.67 ml5. 实验方法酵母的复苏与表型验证 :(1 复苏前 12 天,配制 YPDA 琼脂并于高压消毒后倒板。(2 用无菌接菌环在酵母冻存管中挑取一小团酵母细胞 , 接种到 YPD

12、A 琼脂板 上。(3 30 C倒置孵育35天。(4待酵母长到直径23 mm后,将其接种到不同营养缺陷型培养基上进行表型 验证。质粒转化酵母细胞 ( 常规转化 :(1挑取一直径约23 mm的酵母克隆接种到0.5 ml YPDA培养基中。(2 剧烈震荡使细胞凝块均匀分散。(3 将细胞转移到含有新鲜 YPDA 培 养基 的锥形瓶中。(4 30 C , 250 rpm,振荡孵育 1618 hr,直到稳定期(OD 6001.5 。(5 将过夜培养物转移到含有新鲜 YPDA 培养基的椎形瓶中 , 进一步扩增酵母细 胞。(6 30 C, 230270 rpm, 振荡孵育使 OD 600达到 0.5 0.1(

13、 一般需要 3 hr(7将细胞转移到数个50 mL离心管中,转速1 000 g,室温离心5 min(8弃去上清，加入2550 mL消毒H 2O ,振荡重悬、清洗并收集细胞。(9转速1 000 g,室温离心5 min,弃上清(10加入1 mL新鲜配置的无菌的1 X TE / LiAC 重悬细胞。(11准备1.5 mL无菌EP管,在每个管中加入需要转染的质粒以及担体(carrier DNA 。(12加入经1 X TE/LiAC重悬的感受态细胞，轻柔混匀。(13每个管中加入适量体积的1 ? PEG/LiAC,高速震荡混匀。(14 30 C, 200 rpm,振荡孵育 0.5 hr。(15加入适量体积

14、的DMSO ,温和颠倒混匀，不要振荡。(16 42 C水浴热休克15 min,对于大量转化，应经常摇动以混匀(17置于冰上510 min,室温12,000 ? g离心细胞5 sec。(18移去上清，根据铺的板数加入适量体积的1 ? TE重悬细胞。(19铺板,倒置平板于30 C孵育直到克隆出现。检测目的蛋白在酵母细胞中的表达：(1挑取一直径约2 mm、含有目的蛋白基因片段的BD/X新鲜酵母克隆于5 mL 相应营养缺陷液体培养基 中,30 C、230 rpm 振荡孵育 16 hr 。(2将过夜培养物在50 mL YPDA培养基中扩大培养,30 C , 220250 rpm, 使 OD 600 值达

15、到 0.40.6。(3 1,000? g离心5 min,弃上清。(4加入30 mL H2O ,重悬细胞。1,000 ? g,离心5 min,弃上清，加入液氮 速冻沉淀。(5待液氮挥发完全以后，按照100卩L/7.5 OD600的比例加入crackingbuffer重悬细胞并移入到一个小量转化大量转化质粒DNA0.1 卩 g 20200 卩 g carrierDNA 0.1 mg 2 mg 质粒*7 每管中加入感受态细胞的 体积根据酵母细胞的数量以 及铺板的大小而定 , 通常小量转化每管加入100 yL的感受态细胞；大量转化每管加入1 mL的感 受态细胞。 如果长出来以后克隆太密则可适量减 少每

16、管中加入的感受态细胞 的体积 ； 反之则可适 当增加感 受态细胞的体积。转化酵母菌结果1.5 mL 的 EP 管。(6 按 80 y L/7.5 OD600 的比例向 EP 管中加入酸性玻璃微珠 (glass beads。70 C加热 10 min。剧烈震荡 1 min 。(7 12,000? g, 4 C离心5 min。将上清转移到一个新的1.5 mL EP管中,置于冰上。(8 100 C水浴中35 min,剧烈震荡1 min。(9 12,000? g, 4 C离心5 min。将两次上清合到一个 EP管中。(10取20卩L上清,加入上样缓冲液，100 C变性5 min。(11 SDS-PAG

17、E电泳后，采用Western blot技术检测目的蛋白在酵母细胞中的 表达情况。 小规模酵母杂合 (mating :(1在无菌的1.5 mL EP 管，加入0.5 mL 2? YPDA培养基。(2挑取直径约23 mm、新鲜的含有表达质粒pGBKT7-X的AH109酵母克隆 和含有表达质粒PGADT7-Y的Y187酵母克隆于上述EP管中。(3剧烈震荡1 min,使酵母细胞完全悬浮。(4 30 C, 200 rpm 振摇孵育 2024 hr。(5将杂交混合液按1:100稀释到0.5 ? YPDA培养基中，取100 mL铺到SD/-Trp/-Leu/X- a -Gal 板上。(6倒置平板于30 C孵

18、育直到克隆出现。滤纸转移法检测B-半乳糖苷酶的分泌：(1待酵母长到直径1.53 mm大小时，取无菌、大小合适的 Whatman滤纸贴在 酵母板上。(2待滤纸被琼脂板上的水分基本浸湿后，揭下滤纸,这时酵母克隆被转移到了 滤纸上。(3将附着有酵母克隆的滤纸在液氮中速冻10 sec以上。(4将新配制Z-buffer/X- B -Gal液体滴在另一无菌的 Whatman滤纸上，并完 全浸湿滤纸。酵母杂交操作步骤流程图Y187 Mating SD/-His/-Leu/X- a -Gal-Gal SD/-Ade/-Leu/-Trp/ X- a -Gal AH109(5)将附着有酵母克隆的滤纸小心地贴放在浸

19、有 Z-buffer/X- -Gal的滤纸 上。(6)室温孵育816 hr等待蓝斑出现。 滤纸转移法检测 -半乳糖苷酶的 表达量 诱饵蛋白的文库筛选： Y187 BD-bait AH109 AD-library Pick outpositive clo ne Mat ing Extract ing plasmids TDO/x-Gal DDO/X- -GalQDO/X- -Gal Thransform DH5 a LB/Kan+ Extracting plasmids Retransform into AH109 SD/-Leu Mat ing with BD/Vector Mat ing w

20、ith BD/bait Mati ng with BD/lam DDO plate DDO plate DDO plate QDO/X- -Gal plate QDO/X- -Gal plate QDO/X- -Gal plate酵母双杂交文库筛选操作流程图(1)挑取一新鲜、直径为23 mm的BD-bait 酵母AH109于50 ml SD/-Trp液体培养基，C,30 250270rpm, 16T8 hr，培养至 OD600 值0.8。（2） 1,000 g 离心 5 min，弃上清。用剩余的5 mL左右残液重悬细胞。（3）室温水浴融化冻存的文库（约1mL），轻柔震荡，留取10 L文库用于文

21、库滴度测定（文库滴 度测定方法见 后）。（4）快速将步骤2和步骤3的两种液体混合到2 L的烧瓶中并加入45 mL 2 X YPD/Kan Kan50g/mL）（轻柔震荡；用 1 mL 2YPD/Kan 冲洗装文库的离心管两次，并将冲洗液加入到烧瓶中。（5） 30 C过夜孵育（2024hr）并轻柔震荡（3050 rpm） 。（6）将杂交混合液转移到一无菌离心瓶中，1,000 g离心10 min，弃上清。再用50 mL 2 x YPD/Kan冲洗杂交瓶两次，将 两次冲洗液混合在一起重悬细胞。（7） 1,000 g离心1 0 min，弃上清。用10 mL的0.5 YPD/Ka n重悬细胞，并估算重悬

22、后的总体积， 铺板。（8）倒置 平板于30 C孵育821天直到克隆出现。 （9）挑取阳性克隆于300 L YPDA和150 L消毒甘油的混合液中，冻存于-80 C。阳性克隆验证：（1）用接种环挑取单个阳性克隆接种到新的SD/-Trp/-Leu/-His/ X-Gal平板上，30 C倒置平板孵育。（2）待阳性克隆长出后，再用接种环挑取单个阳性克隆，接种到新的 SD /-Trp/-Leu/-His/X-Gal 平板 或 SD/-Trp/-Leu/-Ade/ -His/X-Gal 平板上，倒置平板于30 C孵育。（3）挑取单个阳性克隆于5 mL YPDA/Kan培养基中30 C, 250270 rp

23、m振摇1216 hr。（4）使用酵母质粒微量抽提试剂盒提 提取质粒，做PCR鉴定。 （8）将pGADT7-cDNA表达质粒转入 AH109酵母株中 将pGBKT7-bait表达质粒转入丫187酵母中，待克隆长出对带有AD-文库蛋白的取质粒。（5）将提取到的质粒混合物（ DH5 大肠杆菌，铺LB抗生素平板。 的抗性一致，这样最终得到的克隆只含有BD/bait、AD/cDNA采用经典转化法转化LB平板中的抗生素与AD/cDNA载体所带AD/cDNA （6）挑取单个阳性克隆于 5mL LB培养基（含相应抗生素）中37 C，250270 rpm 振摇 1216 hr。(7)AH109酵母克隆进行自激活

24、验证，另外再将带有AD-文库蛋 白的AH109酵母克隆与带有BD-bait蛋白的丫187酵母克隆进行杂交，验证阳性克隆的真实性。一2 000bp 500bp 2 000bp 500bp 2 000bp 2 000bp 500bp 500bp 文 库cDNA片段的PCR鉴定文库滴度的测定：（1）将预留的10 L文库与10 L LB混合均匀。（2）取1 L混合液到1 mL LB培养基中，混合均匀，制成稀释溶液 A（1:103） 。（3）再从溶液A中取1 L到1 mL LB培养基中，混合均匀，制成稀释溶液B（ 1:106） 。（ 4）从溶液A中取1 L到50 mL LB培养基中，混合均匀，铺板。（5

25、）从溶液B中分别取50 L和100 L铺板。（6）将板倒置3031 C，孵育3648 hr 。（7）克隆计数并计算文库滴度（cfu/mL ），计算文库滴度的方法如下：A :克隆数 1031032 =cfu/mL B :（克隆数 / 铺板体积）1031031032 = cfu/mL 6. 注意事项（1）酵母双杂交对照的设定 常规的酵母双杂交操作时一般会设定阳性对 照、阴性对照以及显色系统对照三种对照，以MATCHMAKER GA酵母双杂交筛选系统为例： 阳性对照：pGADT7-T + pGBKT7-53其中T蛋白和53蛋白是已经明 确在酵母细胞内能够发生 结合并启动报告基因表达的两种蛋白。阴性对照：PGADT7-T + pGBKT7-lam其中已经明确T蛋白和lam 蛋白在酵母细胞内不能发 生 结合。系统显色对照，pGADT7-Pcl1,该表达质粒转入酵母细胞就能引起-半乳糖苷酶和-半乳糖苷 酶的分泌，从而检测显色系统是否有问题。（2）假阳性现象 多种原因可能造