Promega双萤光素酶报告基因

1、Report Smartly 萤光素酶报告基因技术萤光素酶报告基因技术 自然界的萤光自然界的萤光 发光海星发光甲壳虫 发光真菌发光真菌 发光节虫发光节虫 自然界的萤光自然界的萤光 发光鱼发光甲虫 自然界的萤光自然界的萤光 萤火虫 报告基因的作用报告基因的作用 细胞信号转导途径 启动子/增强子 受体结合 病毒/细胞相互作用 转录因子 药物诱导作用或”效果” 荧光 - Fluorescence 萤光 - Luminescence Fire Worm Luminescence vs. Fluorescence 萤光 （Bioluminescence） 荧光 （Fluorescence） q是化学发光

2、（Chemilumi- nescence） 的一种，激发能量来自化学反应 q 吸收来自光源的光，再发射 另一光子 q萤光发光计（Luminometer）q 荧光计（Fluorometer） 液闪仪（Scintilation Counter） 电荷耦合装置光学成像系统 （CCD opitical imaging system） 荧光显微镜 各种报告基因的优点和缺点各种报告基因的优点和缺点 报告基因优点缺点 萤光素酶 优越的灵敏度 高信号值 无内源活性 需要底物 -gal 灵敏度好细菌，血清等内源活性高 需要底物 GUS（葡糖醛酸糖 苷酶） 灵敏度好 植物中内源活性低 90% 的 E.coli,

3、人动物细胞中 有内源活性 酶的扩散可引起 “过度报告” 需要底物 SEAP（分泌性碱 性磷酸酶） 分泌性报告基因 (不需裂 解) 在 HeLa ,癌 和其它细胞类型 中有高的内源活性 需要底物 CAT（氯霉素转乙 酰基酶） -真核细胞没有背景表达 -易于使用 -设备现成(液闪仪,层析) 放射性的 灵敏度底 50半衰期 GFP（绿色荧光蛋 白） 显微镜: 亚细胞定位 不需底物 背景可能高 折叠 “情形” 可导致信号差别 萤光素酶报告基因的主要优点萤光素酶报告基因的主要优点 非放射性非放射性 检测快（比检测快（比CAT等）等） 灵敏度高灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍） 半衰期短（在理想条

4、件下，可检测到半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20 摩尔的萤光素酶分摩尔的萤光素酶分 子。在哺乳动物细胞中半衰期子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期小时，在植物细胞中半衰期 3.5小时。而小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）小时） 线形范围广线形范围广 （在（在10-16 M(10pg/L)至至10-8 M(1mg/L)范围内范围内,光光 强度与萤光素酶浓度成正比）强度与萤光素酶浓度成正比） 一般比显微镜检测的荧光更灵敏一般比显微镜检测的荧光更灵敏 (对多孔板而言对多孔板而言) 生物萤光比荧光更稳定生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进

5、化的酶能保护光子发射因为自然界进化的酶能保护光子发射 器器 通过基因工程可以延伸生物萤光的性能通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力 萤光素酶报告基因的使用萤光素酶报告基因的使用 原理: 制备含有 luc/ Rluc 的DNA 转染 提供刺激 测量萤光 调节序列 Luc 在活细胞中做报告基因检测在活细胞中做报告基因检测 外界刺激(导引物) 萤光素酶基因 蛋白质折叠 调节序列 加工 转录 转录因子 信号转导 翻译 反义 RNA 受体 蛋白-蛋白 相互作用 RNA 酶 病毒感染 和增殖 RNAi 抑制 启动子启动子/增强子分析增强子分析 “碰撞启动子碰撞启动子”: 全序列全序列: 2) 逐步缺失

6、逐步缺失: Promoter luc+ Light Promoter luc+ Light Promoter luc+ Firefly and Renilla 萤火虫生物萤光的化学萤火虫生物萤光的化学 萤光素萤光素 + ATP + O2 萤光素酶萤光素酶 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Light 萤光素酶萤光素酶: 单体单体, 61,000 Daltons 辅辅-底物底物: ATP . Mg 2+ 萤光素萤光素: Mg2+ 海肾萤光素酶反应海肾萤光素酶反应 Coelenterazine + O2 萤光素酶萤光素酶 Coelenteramide + CO2 +

7、 Light 萤光素酶萤光素酶: 单体单体, 36,000 Daltons 萤光素萤光素: (Coelenterazine) Enzyme structures FireflyRenilla 为什么要使用双报告基因为什么要使用双报告基因 报告基因 A (首要信号) 报告基因 B (第二信号) 特异生物学反馈 + 非特异生物学反馈非特异生物学反馈 检测结果 比较首要与第二信号确定 特异生物学反馈 细胞可能有内源脱乙酰基酶 -Gal 或 GUS 活性. CAT, -Gal 和 GUS 检测是终点检测. 不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或- Gal ,的两个报告基因的检测都灵敏而快速 传

8、统的双报告基因的缺点传统的双报告基因的缺点 双萤光素酶报告基因系统比用双萤光素酶报告基因系统比用CAT和和-Gal做内对照做内对照 的优点的优点 速度 样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内 完成 灵敏 两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内 源萤光素酶背景极低 方便 一管完成检测，样品不必分份 实验质粒 对照质粒 用海肾萤光素酶作对照归一实验变化 归一反应 = 对照的（海肾萤光素酶) 实验的 (萤火虫萤光素酶) 萤火虫萤光素酶 海肾萤光素酶 用两个萤光素酶做报告基因用两个萤光素酶做报告基因 （萤火虫（萤火虫+海肾）海肾） 数据处理举例数据处理举例 第一天萤光素酶活性(RLU)

9、比率 归一的活性 样品处理重复（F:R) 变化倍数 对照 5,128 2,511 7,553 3,815 10,555 5,413 7,745 3,913 1.981.00 处理 5,1376 4,467 40,712 3,574 88,787 7,654 6,0292 5,232 11.525.82 处理B 1 587,635 5,144 988,347 8,832 3 409,881 3,564 661,954 5,847 113.2157.18 第二天 对照 15,529 20,433 0.76 21,897 30,841 0.71 10,760 13,620 0.79 16,062 2

10、1,631 0.741.00 处理 850,239 20,843 578,951 14,830 943,873 21,788 791,021 19,154 41,3055,81 处理D 1 14,865 19,3-05 8,967 12,284 13,767 20,246 12,533 17,278 0.730.99 活性倍数 (F/R)样品 = F/R)对照 第二天处理计算如下： 活性倍数 (791,021/19,154) = （16,062/21,631) = 55.81 GloMax 20/20Single tube luminometer GloMax 96 luminometer W

11、hite microplates for luminescence Promega公司出品的双报告基因实验产品公司出品的双报告基因实验产品 质粒 萤火虫萤光素酶质粒 海肾萤光素酶质粒 叩头虫萤光素酶质粒 检测系统 非均质双报告基因检测系统（通量较低） 均质的双报告基因检测系统（适合高通量，自动化） 载体 - 萤火虫萤光素酶载体 pGL3 家族家族 pGL3-Basic pGL3-Control pGL3-Enhancer pGL3-Promoter pGL3-Basic Map pGL3-Control Map pGL3-Enhancer Map pGL3-Promoter Map 辅助报告基

12、因的相对萤光单位辅助报告基因的相对萤光单位 (RLU) 启动子交叉交谈或互相干扰启动子交叉交谈或互相干扰 实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节 内对照载体可能存在的问题内对照载体可能存在的问题 载体载体 - 海肾萤光素酶报告基因载体海肾萤光素酶报告基因载体 第二代第二代第一代第一代 phRL-null pRL-null phRL-TK pRL-TK phRL-TK (int-) phRL-SV40 pRL-SV40 phRL-CMV pRL-CMV phRG-B phRG-TK RenillaRenilla 萤光素酶载体系列萤光素酶载体系列 内含子 T7 启

13、动子 CMV即时早期增强子/启动子 phRL-CMV HSV TK 启动子 phRL-TK SV40 晚poly(A) SV40 早期 增强子/启动子 phRL-SV40 MCS phRL-null hRL 基因 TK 启动子 phRL-TK(Int-) MCS phRG-B 合成 poly(A) 信号 转录停止位点 三个读码框的 终止密码子 phRG-TK 合成 poly(A) 信号 转录停止位点 三个读码框的 终止密码子TK 启动子 hRL 基因 SV40 晚 poly(A) RenillaRenilla 萤光素酶载体系列萤光素酶载体系列 用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因用萤火虫和海肾

14、两个萤光素酶做报告基因 Dual-Luciferase 双萤光素酶报告基因系统（ 非均质检测） E1910，100次 E1960，E1980，1000次 Dual-GloTM 萤光素酶检测系统 （均质检测） E2920，10ml E2940，100ml EE2980，10X100ml 均质检测与非均质检测均质检测与非均质检测 发光 细胞+培养基 添加试剂 细胞+培养基除去培养基 发光 清洗细胞裂解细胞添加试剂 均质检测 非均质检测 Dual-Luciferase报告基因检测系统组分报告基因检测系统组分 检测缓冲液II 底物（冻干粉） Stop&Glo缓冲液 Stop&Glo底物,50X 被动裂

15、解液,5X Dual-Luciferase报告基因检测步骤报告基因检测步骤 裂解细胞 被动裂解 除去培养基.PBS洗.加1XPLB, 振荡15分钟.检测 主动裂解 除去培养基.PBS洗.在1XPLB中刮下细胞.细胞转移到试 管或小瓶中.1-2次冻融.检测 检测 双萤光素酶检测方案双萤光素酶检测方案 1 支试管 2 步检测 30 秒钟 Luciferase Assay Reagent II Passive lysis buffer Stop&Glo Reagent DLRTM For HTS DLR双报告基因检测系统应用举例双报告基因检测系统应用举例 黑色素刺激激素黑色素刺激激素(-MSH)对由

16、人酪氨酸酶启动子增对由人酪氨酸酶启动子增 强子控制的萤光素酶的表达的诱导强子控制的萤光素酶的表达的诱导(Promega eNotes) 目的：目的：监测细胞对-MSH诱导的应答 材料：材料： 实验载体：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶启动子增强子Luc(+) 阳性对照：pGL3-Control 阴性对照：pGL3-Basic 内对照：pRL-SV40 B16-F1细胞（鼠黑素瘤细胞系CRL-6323) DLR 双萤光素酶检测试剂盒 步骤步骤 前一天：接种细胞，六孔板X3 第二天：共转染：pGL3-Try14A和pRL-SV40（分成两组） pGL3-Control和 pRL-SV40 pGL

17、3-Basic和 pRL-SV40 裂解细胞，测量萤光 Dual-Glo萤光素酶检测系统萤光素酶检测系统 检测特点检测特点 均质检测，为高通量检测而设计均质检测，为高通量检测而设计 萤光信号稳定，萤光信号稳定，2hrs内检测内检测 自发萤光低于检测水平自发萤光低于检测水平 Dual-Glo Assay: 同一样品中检测两种萤光信号同一样品中检测两种萤光信号 Stable luminescence signals for both reporters (t1/2 3.5 hrs.) 10,000-fold signal separation between the firefly and Ren

18、illa bioluminescence Primary reporter: Firefly bioluminescence Secondary reporter: Renilla bioluminescence Cells in culture medium Add firefly assay reagent Add combination firefly quench reagent & Renilla assay reagent Dual-Glo assay-选择性淬灭萤火虫萤光 Selective quench of firefly luminescence Dual-Glo萤光素酶检

19、测系统萤光素酶检测系统 试剂盒组成 Dual-Glo萤光素酶缓冲液 Dual-Glo萤光素酶底物（冻干粉） Dual-GloStop-Glo缓冲液 Dual-GloStop-Glo底物 操作步骤操作步骤 试剂制备简单试剂制备简单 将Dual-Glo 萤光素酶缓冲液倒入 Dual-Glo 萤光 素酶底物中 用Dual-Glo Stop &Glo 缓冲液按1:100 稀释 Dual-Glo Stop &Glo 底物 所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于 20C 两步加入试剂两步加入试剂: 加加, 读读, 加加, 读读 10,000 倍信号分离倍信号分离 (淬灭淬灭) 用两个萤光素酶做报告基因用两

20、个萤光素酶做报告基因 Chroma-LucTM载体 Chroma-Glo检测试剂 E.Coli 表达的表达的Chroma-LucTM 基因基因 Chroma-LucTM 基因和载体基因和载体 三个基因三个基因: 1. CBRluc 发红光的萤光素酶发红光的萤光素酶 2. CBG99luc 发绿光的萤光素酶发绿光的萤光素酶 99.0% DNA 相同于相同于 CBRluc 3. CBG68luc -发绿光的萤光素酶发绿光的萤光素酶 68.9% DNA相同于相同于 CBRluc 两种载体骨架两种载体骨架: 1. 对照对照 置换了置换了 pGL3-Control 的的luc+ (pCBR-Contro

21、l, pCBG68-Control, and pCBG99-Control) 2. Basic 置换了置换了 pGL3-Basic 的的luc+ (pCBR-Basic, pCBG68-Basic, and pCBG99-Basic) 合成的合成的 Chroma-LucTM 萤光素酶载体骨架萤光素酶载体骨架 Control Basic Enhancer Chroma-LucTM 基因 SV40 启动子启动子SV40 增强子增强子 SV40 增强子增强子 (合成的或天然的基因) Chroma-LucTM 基因 Chroma-LucTM 基因 Chroma-Glo 检测的化学检测的化学 Lucif

22、erin + ATP + O2 Luciferase Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Light Luciferase: Monomeric, 61,000 Daltons Co-substrates: ATP . Mg 2+ Luciferin: 不同颜色，同样试剂？不同颜色，同样试剂？ C2 C2 旋转，较少 能量，红光 不旋转，较多 能量, 黄绿光 Chroma-LucTM 萤光素酶滤光片选择萤光素酶滤光片选择 0 20 40 60 80 100 120 450500550600650700 Wavelength (in nm) Percent of m

23、aximum luminescence CBG68luc CBG99luc CBRluc 510/60nm610nm Long pass Chroma-Glo 检测的特点检测的特点 为高通量检测设计，检测为高通量检测设计，检测96-、384-孔板孔板 均质检测均质检测 需要带滤光片的萤光发光计需要带滤光片的萤光发光计 pGL4: A New Family of Reporter Vectors Next generation reporter vectors (pGL4) Improved Reporter Performance Improved Expression of luc2 Pro

24、vides 5 -10 x higher expression than luc+ in mammalian cells Large reduction of consensus sites where inappropriate interactions with host may occur Sites removed from vector, reporter genes, and selectable markers: Restriction sites Vertebrate TF binding sites Promoter modules Eukaryotic splice acc

25、eptor and donor sites Eukaryotic poly A sites Kozak sequences Reduction in Consensus Binding Sites Increased Response Using Rapid Response Luciferases Compared to regular luciferase, Rapid Response luciferases gave higher induction in shorter time. Induction at 3h 192 79 150 为什么需要快速反应萤光素酶基因？ （现存报告基因

26、的缺点） 研究者想要报告基因应答与细胞事件在时间上更快地耦联在时间上更快地耦联 需要需要更强的应答更强的应答 较长的敷育时间可能导致检测到次级效应次级效应(假阳性假阳性) Rapid ResponseTM 报告基因技术报告基因技术(不稳定的萤光素酶基因) 细胞内报告 基因池 信号信号 新表达的新表达的 报告基因报告基因 为什么快速应答的报告基因应答性更强为什么快速应答的报告基因应答性更强? 快速应答快速应答 非非-快速应答快速应答 新表达的新表达的 报告基因报告基因 信号信号 基于报告基因稳定性的动力学模型基于报告基因稳定性的动力学模型 pGL4 Rapid Response Reporter

27、s Gene Design VectorGeneDesign pGL4.10 luc2luc2 pGL4.11 luc2Pluc2P pGL4.12 luc2CPluc2CP pGL4.70 hRluchRluc pGL4.71 hRlucPhRlucP pGL4.72 hRlucCPhRlucCP luc2 hRluc luc2hPEST luc2hCL1hPEST hRluchPEST hRluchCL1hPEST 快速应答报告基因的设计快速应答报告基因的设计 蛋白降解序列蛋白降解序列 来自PEST鼠鸟氨酸脱羧酶的序列 (40 aa) 来自酵母CL1 序列 (18 aa) RNA 降解序列降解序列 根据saimiri疱疹病毒小核 RN