植物生理学研究技术实验指导

1、实验一、叶片培养-植物组织培养中的脱分化与再分化过程 在组织培养中，一个成熟细胞或分化细胞转化为分生状态的过程，也就是愈伤组织形成的过程， 称为脱分化(dedifferentiation)。植物的成熟细胞经历了脱分化之后，形成愈伤组织，由愈伤组织能再形成完整的植株，这一过程称为再分化(redifferentiation)。影响细胞分化和器官建成的内外因素(光照、温度、湿度、营养、激素等)很多，植物激素是最关键的因素，其中生长素和细胞分裂素的比例起决定作用。Skoog和Miller(1957)就提出了有关植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素和细胞分裂素比率的函

2、数，通过改变培养基中生长素和细胞分裂素的相对浓度可以控制器官的分化；IAA/CTK比值高时促进生根，低时促进茎、芽的分化，两者浓度相等时，组织倾向于以一种无结构的方式生长。对多数物种，激素调控器官发生都适用，但由于各种植物或不同的器官（及组织）中的内源激素的含量和动态变化不同，因此对于某一种具体的形态发生过程而言，它们所要求的外源激素水平也会有所不同。实验目的：通过此实验使学生初步掌握植物组织培养的基本方法，并了解植物细胞的脱分化和再分化过程以及植物激素的调控作用。实验原理：根据“植物细胞全能性”的理论，植物细胞具有全套遗传信息，在适当条件下，可以通过脱分化和再分化途径进行器官发生，并进一步发

3、育成完整再生小植株。在细胞分化和器官发生过程中，植物激素起着重要的调控作用，在植物激素不同的浓度配比下诱导外植体向不同的方向分化。实验材料：烟草叶片。仪器设备：高压灭菌锅，超净工作台，光照生长箱，pH汁、电炉，烧杯，搅棒，容量瓶，试剂瓶，量筒，移液管，白搪瓷杯，三角瓶，培养皿，酒精灯，手术刀，镊子，手术剪等。试剂:酒精,氢氧化钠,6-苄基嘌呤(BA),萘乙酸（NAA）和MS培养基中无机盐和有机物。实验步骤:1.配制培养基 按MS培养基配方(见附录)，配制各母液。(1)按下表，配制lO倍大量元素母液。lO倍大量元素母液:大量元素NH4NO3KNO3CaCl2 2H2OMgSO4 7H2OKH2P

4、O4重量(g) 16.519.04.43.71.7用蒸馏水溶解定容至1000毫升(CaCl2 2H2O需单独溶解，稀释后再与其它大量元素溶液混合)（2）按下表，配制100倍的微量元素母液。100倍的微量元素母液:微量元素KIH3BO3MnSO44H2OZnSO4 7H2ONaMoO4 2H2OCuSO4 5H2OCoCl2 6H2O重量（mg）836202230860252.52.5用蒸馏水溶解，定容至1000 ml (MnSO44H2O 需先用少量1NHCl溶解，然后再与其它微量元素溶液混溶)。（3）200倍铁盐母液的配制:称取Na2EDTA： 3.37g；FeSO47H2O：2.78g，用

5、蒸馏水溶解并定容至500ml(溶解时可加热)。（4）有机附加物的配制：20mg/ml 的肌醇溶液:：称取2g肌醇，用蒸馏水定容至100ml。0.5mg/ml的烟酸溶液：称取50mg烟酸，用蒸馏水溶解后定容至100ml。1.0mg/ml的甘氨酸溶液：100mg的甘氨酸，用蒸馏水溶解后定容至100ml。0.5mg/ml 的盐酸吡哆醇（VB6）溶液:50mg盐酸吡哆素，用蒸馏水定容至100ml。0.1mg/ml盐酸硫胺素（VB1）溶液:10mg盐酸硫胺素，用蒸馏水定容至100ml。（5）植物激素的配制：103mol/L的萘乙酸（NAA）溶液：称取18.6mg 萘乙酸，用少量95乙醇溶解后，用蒸馏水稀

6、释并定容至100ml。103mol/L的6-苄基嘌呤 (BA) 溶液: 称取22.5mg BA，用少量lmol/L的HCl溶解后，用蒸馏水稀释并定容至100ml。2 将各种元素母液混合,配制MS培养基,其中1L体积中含大量元素母液100ml微量元素母液10ml铁盐母液5ml肌醇母液5ml甘氨酸母液2ml烟酸母液1ml盐酸硫胺素（VB1）母液1ml盐酸吡哆醇（VB6）母液1ml蔗糖30g琼脂7g再按下列浓度分别加入萘乙酸和6-苄基嘌呤母液：培养基123NAA1106 mol/L1106mol/L5107mol/LBA1106mol/L1107mol/L1106mol/L (注意: 1号培养基需加

7、入103mol/LNAA母液lml，103mol/LBA母液lml;2号培养基需加入103mol/LNAA母液lml，103mol/LBA母液0.1ml;3号培养基需加入103mol/LNAA母液0.5ml，10-3mol/LBA母液1ml)3 煮沸培养基并分装将培养基定容到1000ml后，用l mol/LNaOH或l mol/LHCl调pH值至5.8，煮沸培养基，使琼脂、蔗糖溶解，然后将培养基分装到100ml三角瓶中，每瓶40ml左右，用锡纸封口后放入高压灭菌锅中，在120(104kPa)下灭菌15min。冷却后备用。4 外植体消毒与接种(1)提前半小时打开超净工作台，用70酒精喷雾降尘，半

8、小时后备用。然后用酒精棉球擦拭超净台面，并将所用的一切用具在酒精灯火焰下消毒，冷却后备用。(2)外植体消毒：取烟草幼嫩展开叶片，用自来水冲洗2 5小时后，在超净工作台上消毒，将叶片浸入70酒精中5s，之后移至2次氯酸钠溶液内消毒 8 10min，用无菌水冲洗4 5次。(3)接种:将消毒后的烟草叶片转入灭过菌的培养皿中，用手术刀切除主脉和大的侧脉，将叶片组织切成5 5mm的小块，每个三角瓶内接入3 4块组织。5 培养接种后，置于光照培养箱中，在光照10h /d，光强1500 2000Lx，温度251oC条件下培养。6 结果计算与分析:接种后每周观察一次，记录外植体上愈伤组织、不定根、不定芽出现的

9、时间。四周后统计每种培养基上外植体生长和分化的情况，并根据实验结果进行分析。培养基愈伤组织数根数芽数123分析实验结果并说明原因。思考题:1. 植物组织培养实验应注意哪些问题才能成功?2. 在本实验采用的三种培养基中，愈伤组织和器官分化的情况如何? 试解释不同激素所起的作用。参考文献，1. Chawla H.S. (ed) Plant Biochnology A Practical Approach. Science Publishers, Inc. 20032. Razdan M.K. (ed) Introduction to Plant Tissue Culture Second Edit

10、ion. Science Publishers, Inc. 20033. Soh W-Y and Bhojwani (eds.)Morphogenesis in Plant Tissue Cultures. Kiuwer Academic Publishers 19994. Hall R.D. eds.Plant Cell Culture Protocols. Humana Press 19995. Collin H.R. and Edwards eds. Plant Cell Culture. BIOS Scientific Publishers Limited 1998 实验二、红外线CO

11、2测定法测叶片的光合速率、呼吸速率以及CO2补偿点一、前言： 叶片光合速率的测定，比用离体的细胞、叶绿体或类囊体进行的研究手续简便，对植物体的破坏和干扰较少，更能反映自然条件下植物体内光合机构运转的实际状况，便于连续观测光合机构对植物体内外因素变化响应与适应的动态过程。当然，叶片光合速率的测定也有其不利的一面，那就是叶片，特别是连体叶片，是一个比离体细胞、叶绿体和类囊体复杂得多的体系，不仅测定时植物体的内外条件常常变化而难于控制，而且对所测结果的解释也复发得多，困难得多。因此，把叶片光合速率的测定与离体研究结合起来，可以深刻而又恰当地说明问题。红外线CO2测定法在田间和室内都可以用，既可用于离

12、体叶片，又可用于连体叶片，显示出较大的优越性，特别是随着技术的发展，内装微型计算机的便携式光合气体分析系统的出现，使它变得更加简便、迅速、准确，因此得到越来越广泛的应用。二、实验目的： 掌握用红外线CO2测定技术定量测定光合强度与呼吸强度的方法。三、实验原理： 气体样品中的CO2浓度可以通过红外线技术进行较精确的定量测定。CO2对红外线有较强的吸收，CO2量与红外线吸收间有线性关系，不同浓度的CO2对红外线的吸收强度不同。通过被测气体样品的部分红外线被样品中的CO2吸收后其能量发生损耗，损耗的能量与样品中CO2浓度成正比。因此，由测得的红外线能量变化的数值可计算出被测样品中CO2的浓度，一般常

13、用的红外线CO2测定仪可自动完成这一换算，直接给出样品中CO2浓度的数值。试验前后仪表上反映的CO2浓度之差，即为植物光合作用时一定叶面积吸收CO2的量，或呼吸作用时一定重量的植物所释放的CO2的量。如果用闭路气路，在一定光照条件下进行试验，恒定后仪表上反映的CO2的量为植物的CO2补偿点。四、实验材料与仪器设备：1. 材料、设备：盆栽或大田生长的玉米叶片，CB-1101型光合蒸腾测定系统。2. 叶室：叶室是放置待测植株或叶片的装置，叶室大小和形状根据材料的大小和形状而定。该仪器所用的叶室根据需要可进行选择，开路叶室类型如表1所示，闭路叶室有1/4升、1/2升、1升和4升等类型。表1 开路叶室

14、的窗口大小叶室类型窗口大小（宽 长 mm）窗口面积（cm2）方型25 256.25宽长型55 2011窄长型65 106.5小圆筒型25 9022.5大圆筒型50 7035圆型直径182.543. CO2浓度调节装置：测定光合强度时，一般只要引进外界环境气流既可，但由于气体流量的大小会影响叶室进气管首尾两端CO2浓度差异的大小，因而要适当增加通气量。但通气量又不宜过大，应以提高CO2定量装置的精确为前提。可通过转子流量计来控制流量，使气流以0.6升/分钟的流速进入主机。4. 气路系统：根据测定方法的不同分为开路测量气路和闭路测量气路两种，分别如图1和图2所示。参考气过滤器泵流量调节阀流量计叶室

15、过滤器水分分析器CO2分析器INOUT图1 开路测量气路图过滤器泵流量调节阀流量计叶室过滤器水分分析器CO2分析器INOUT图2 闭路测量气路图 开放系统和封闭系统的主要区别在于：前者将分析仪分析过的气体排放到空气中，而后者是让空气在叶室与分析仪之间循环流动。相比较而言，封闭系统有明显的缺点：由于测定过程中CO2浓度不断变化，所测得的不是稳态的光合速率；测定过程中叶片周围环境条件很容易变化，如增湿、升温等；不适于连续观测光合速率变化的动态过程；对系统的密闭性要求高；系统总体积的测定不大方便。五、实验步骤：1. 开机预热：按下“电源”开关键，这时CO2分析器开始工作，预热4分钟。2. CO2分析

16、器调零：把从流量计上连接出来的标有“IN1”和“OUT1”的管子分别与面板上的“IN1”和“OUT1”接气嘴相连。然后把碱石灰管两端标有“IN”和“OUT”的管子分别与面板上的“IN”和“OUT”接气嘴相连。待CO2分析器预热4分钟后，按下“泵”开关键，调节流量至0.6升/分钟，然后按下“开/闭路”开关键和“参/初”键，当CO2参/初值显示器读数稳定时，调节“CO2调零”旋钮，让CO2参/初值显示器读数为零，然后按下“完成”键，至此调零完成，取下碱石灰管。3. CO2分析器调满：把从已知浓度的CO2标准气接出来的管子（对于压缩气必须用三通连接器，用以排放多余气体）接在“IN”接气嘴上。按下“参

17、/初”键，当CO2参/初值显示器读熟稳定时，调节“CO2调满”旋钮，使CO2参/初值显示器读数与已知浓度的CO2标准气浓度一致，然后按下“结束”键，至此调零、调满完成。按起“开/闭路”开关键，取下与面板上“IN”接气嘴相连的管子，并关掉标准气开关阀门。仪器在每次开机后都需要进行调零；同时应周期性地用已知浓度的CO2标准气进行跨度校准（建议每月进行一次，校准越频繁，测量结果越准确）。4. 测量：CB-1101型光合蒸腾测定系统具有开路、闭路两种测量方式。4.1 开路测量方式：把连接参考气源的管子连接到面板上的“IN”接气嘴上，并把手柄上的两根标有“IN2”和“OUT2”的管子分别与面板上的“IN

18、2”和“OUT2”接气嘴相连，同时把手柄上的传感器电缆插头插到面板上的“手柄连接”插座上并拧紧。按下“开/闭路”开关键（此灯亮表示选择开路测量，否则为闭路测量），然后把要测量的叶片夹到叶室上，接着按下“参/初”键，当CO2参/初值显示器显示的CO2浓度值相对稳定后按下“测/终”键，当CO2测/终值显示器显示的CO2浓度值相对稳定后按下“完成”键，至此此次测量结束，记下各显示器的值。如要进行重复测量则重复上述步骤既可。开路测量完毕，按起“开/闭路”键，结束开路测量方式。4.2 闭路测量方式：把管子两端标有“IN”和“OUT”的管子两端分别连接到面板上的“IN”和“IUT”接气嘴上，并把手柄上的两

19、根标有“IN2”和“OUT2”的管子分别与面板上的“IN2”和“OUT2”接气嘴相连，同时把手柄上的传感器电缆插头插到面板上的“手柄连接”插座上并拧紧。选择闭路测量方式（如之前已进行过开路测量且“开/闭路”开关键上的指示灯仍亮着则先要按起“开/闭路”开关键），然后把要测量的叶片夹到叶室上，接着按下“参/初”键，当CO2参/初值显示器显示的CO2初始浓度值满足要求时，按下“测/终”键，此时计时显示器开始计时（单位为秒），待CO2测/终值显示器显示的CO2浓度值满足要求时（一般下降30 mL/L）,按下“完成”键，结束此次测量，记下各显示器的值及所用时间，如要进行重复测量，重复上述步骤既可。5.

20、关机：依次按起“开/闭路”开关键、“气泵”开关键、“电源”开关键。同时为了使按键“参/初”、“测/终”、“完成”不处于长期疲劳状态，关机前用手指轻触这三个键中弹起的两个键中的任意一个，使三个键都保持弹起状态。6. 结果计算：开路系统的净光合速率Pn（mmolm-2s-1）Pn = - V/60 273.15/Ta P/1.013 1/22.41 10000/A （C0-Ci）V体积流速（升/分钟）；Ta空气温度（K）；P大气压力（bar）；A叶面积（cm2）；C0出气口CO2浓度（mL/L）；Ci进气口CO2浓度（mL/L）闭路系统的净光合速率Pn（mmolm-2s-1）Pn = - V/t

21、273.15/Ta P/1.013 1/22.41 10000/A （C0-Ci） V叶室容积（升）；t间隔时间（秒）； Ta空气温度（K）；P大气压力（bar）；A叶面积（cm2）；C0终止时CO2浓度（mL/L）；Ci初始时CO2浓度（mL/L）7. 呼吸速率测定：具体操作过程基本同光合速率测定。测定植物叶片的呼吸速率时要在暗中进行。应视植物材料呼吸作用的强弱，适当调控气源CO2的流速，方可获得比较满意的结果。六、注意事项：1. 调满完成后将满度电位器的刻度记下，以免不小心旋动调满旋钮导致重新调满。2. 没有稳定的参考气源时，可用一个大的缓冲瓶代替，比如一个装过纯净水的大塑料桶，但其内部一

22、定要干燥，在桶的细颈上罩一个纸杯，杯底捅一个小洞，这样就做成一个很好的缓冲瓶，但在罩纸杯之前要摇换晃桶防止其内部CO2浓度与外界相差太大。另外3米以上高度的空气也比较恒定，因此可以用一根管子将“IN”与3米以上高度的空气相连。3. 流量调节必须在CO2分析器调零时进行。这是因为电磁阀在切换到不同路径时对气流的阻力不同，而CO2分析器调零时的流量值参与计算的流量值相同（电磁阀状态相同）。此外流量计读数时应该垂直放置。4. 仪器在进行测量时必须平放。仪器内部无论气路还是电路绝对不允许进水。另外在田间测量时要避免在多尘的条件下测量。5. 当叶片被从黑暗中转移到光下或从弱光下转移到强光下时，叶片的光合

23、作用需要经过一个或长或短的诱导期才能达到光合速率较高的稳态。因此，只有在CO2测/终值显示器显示的CO2浓度值相对稳定后，才可读数。6. 叶室的窗口与手柄的光量子传感器应处于同一光照条件下，使得测到的光合有效辐射与所测叶片的真实情况一致。七、思考题： 在大田试验中，取材和测量顺序等方面应该注意一些什么问题？实验三、植物激素乙烯的测定:气相色谱法一、前言:植物激素可用不同的方法来测定，如生物试法、兔疫分析、物理化学方法等。在物理化学方法中，色谱法(包括气相色谱、高压液相色谱和质谱等)可用于检测已知的各种植物激素，具有高选择性、高灵敏度、高分离效能、样品用量少和测定快速等优越性，能对组分相近或复杂

24、的物质进行常量和微量的分析。由于乙烯是气体，用其它方法不易检测，最适宜用气相色谱法来测定。二、实验目的:乙烯在植物对环境的适应、器官脱落和果实成熟等生长发育过程中起重要的调节作用，通过本实验进一步认识植物产生乙烯的重要生理作用和规律，学习掌握用气相色谱仪测定乙烯的原理和技术。三、实验原理:不同物质在两相中分配和吸附不同而分离。SQ-204型气相色谱仪是以气体为移动相，即用氮气作为载气、固体颗粒(交联的高分子聚合物GDX-502.60-80目)为固定相的气固色谱，样品被汽化后，载气带动样品通过色谱柱样品中的各组分在固定相和移动相间进行连续多次分配，由于样品的不同组分在两相间分配系数不同，固定相对

25、各组分的吸附力不同，使各组分在色谱柱中的运行速度产生差异，经一定距离后各组分被分离开，由载气 (N2)将它们分别冲洗出来顺序进入检测器，产生电讯号经放大器放大后在记录仪上绘出各组分的色谱峰。测定乙烯用氢火焰检测器，基本原理是氢气与载气带着的分离组分在喷口下汇合，经引燃在空气中燃烧，有机物在火焰中因化学电离产生离子，在电场作用下形成离子流，由收集极收集的电子形成电流，通过负载高阻产生电讯号，经微电流放大器放大后，输入记录仪。果实在成熟过程中常产生大量乙烯，植物幼苗在遭受逆境或某些生长调节剂处理时也会产生乙烯，而后引起一系列生理生化效应，本实验用密闭容器收集植物材料产生的乙烯，经气相色谱仪检测后分

26、析受伤或其它处理对乙烯产生的诱导。四、 材料、仪器设备和试剂:SQ-204型气相色谱仪(图6-1)，氮气、氢气和空气钢瓶，记录仪，注射器，秒表、标准乙烯气袋和标准乙烯，储气瓶，梨、苹果、香蕉、番茄等果实或植株的器官。五、实验步骤:1 称取一定量的待测植物材料，放入储气瓶中，进行不同的处理，如受伤、水分或温度胁迫，加入乙烯生物合成促进剂或抑制剂等。在适宜温度下(25oC)置放12-18小时。2 SQ-204型气相色谱仪单氢焰检测器测定乙烯的操作步骤1) 连接好载气、空气和氢气的管路，检查各种气体的气路不能漏气。接通电源。2) 打开载气 (N2)钢瓶减压阀，载气以稳定的压力和流速流出，经气体过滤器

27、吸潮和纯化后进入柱箱，调节柱箱上气流表，指示在0lMpa以下(预热阶段使其稍低些)。3) 打开温控器开关，调节汽化室温度，使其达到100oC。4) 打开放大器开关，将基流补偿电位器逆时针旋到头，置于零处，衰减按键开关全部跳起，此时衰减K=。图6-1SQ一204型气相色谱仪流程图5)调节温控器上的热导色谱柱温度至80oC(分离乙烯的温度，一般低于气化室温度)，按下按键，为防止检测器结水，注意在操作中应先升检测器汽化温度，后升柱箱温度。7）调节放大器衰减按键K8或16。输入高阻量程为1010A/mv。记录仪满刻度12mv，走纸速度2mm/mv。基线应稳定，噪声0.O05mv。8)点火:打开空气和氢

28、气钢瓶上的减压阀，调节柱箱氮气进入量稍小些，空气和氢气进入指示约在(0.lMPa，点火。当听到扑的一声说明火己点着。9)测定:再用放大器上的调零旋钮调节记录仪，使记录笔落在零点处，调节记录仪走纸速度为4mm/s。可先将衰减放在最大处(1024档)，以避免气体浓度太高使指针打出范围而损坏放大器。如此档不出峰或太小，根据具体情况将衰减调至适当的位置用注射器从标准乙烯气袋抽取1ml标气，立即注射，等待出峰，记录保留时间。抽取各处理的样品气体1ml，同法进行测定，各样品测定重复3次。10)测定完毕后依次关闭记录仪，温控器，检测器，空气和氢气阀，氮气再流动一段时间后关闭。六、实验结果计算与分析:1记录标

29、准乙烯和各样品出峰的保留时间tm，这是样品进入色谱柱后各组分在柱内停留的时间，据此可对物质组分进行定性判断。2 用峰高定量法进行定量计算（标准乙烯含量/标准峰高)样品峰高衰减系数样品乙烯含量 (ppm) 标准乙烯衰减系数 样品乙烯产生率(moI/kgfw.h)(气体体积/22.4)样品乙烯含量鲜重 产气时间思考题：1、分析实验中所得结果，说明在用气相色谱仪测定乙烯时应注意哪些问题。2、根据所学生理知识和农业生产需要，设汁测定乙烯的实验处理。实验四、植物叶片气孔运动的调节一、前言: 植物叶片表面密布的气孔是植物和环境进行气体和水分交换的门户气孔孔径的大小调节着光合作用和蒸腾作用等重要生理过程。气

30、孔开放与关闭的现象称为气孔运动。气孔运动对许多内源(如激素)与外源因子(如光照、湿度、二氧化碳浓度等)的变化非常敏感，而且利用仍带有气孔结构的活的叶片表皮组织可以在离体条件下方便地研究气孔运动的调节过程甚至机制因此气孔运动及其调节是研究植物细胞信号转导的理想模型之一。二、实验目的：本实验用蚕豆叶片下表皮为材料，观察光、湿度、CO2、K+ 、Ca、植物激素对气孔运动的调节，认识植物和环境的密切关系。检测在光暗条件下保卫细胞由K+的变化，证实K在调节气孔运动中的重要作用。三、实验原理:气孔复合体由一对保卫细胞 (有的有副卫细胞)组成，组成气孔的保卫细胞对光、温度、湿度、CO2等环境因子以及一些植物

31、激素非常敏感。保卫细胞接收信号后，经过胞内信号转导，保卫细胞渗透势变化引起保卫细胞吸水或失水，使气孔开放或关闭，而K+是调节保卫细胞渗透势的重要物质，因此气孔的运动伴随着K+的迁移,如在光下，K+大量进入保卫细胞，渗透势下降，细胞吸水，气孔张开，反之，气孔关闭。四、材料、仪器设备和试剂:1植物材料:3-4周令的蚕豆幼苗、鸭趾草或玉米幼苗。2仪器设备:显微镜、显微测微尺、日光灯、剪刀、镊子、烧杯、移液管、滴管、载玻片、盖玻片、毛笔、吸水纸、单面刀片、培养皿。3试剂:100mMKCl溶液、10OmMCaCl2溶液、lMNaOH溶液 10亚硝酸钻钠溶液(新鲜配制，加冰醋酸酸化)、5硫化胺5%甘油 1

32、0mM Tris缓冲液(pH6.1)、lmM IAA、lmM 6-BA、lmM ABA五、实验步骤:1、表皮组织处理:将实验材料分别置光照和黑暗条件下;从在光照和黑暗条件下的植株上取完全展开的叶片撕取下表皮用毛笔沽水轻轻地刷去表皮条上的叶肉细胞，切成5mm2的小块，进行不同的处理和观察。2、 光、暗对气孔孔径的影响及厂的分布:分别取光下和暗中的叶片下表皮，在显微镜下观察气孔，用显微测微尺测定气孔孔径，随机取2个视野，每个视野测量10个气孔，计算孔径平均值和标准差。把表皮放在冷冻的蒸馏水中冲2min，以洗去外部的K+，放入冷冻的亚硝酸钻钠溶液中15Min， ，取出用冷冻蒸馆水冲洗到水不发黄，将表

33、皮条浸入硫化铰一甘油溶液中，室温下2min ，用蒸馏水洗去外部多余的硫化胺，在显微镜下观察比较保卫细胞内的K+积累情况。3、水分胁迫下叶片上气孔的适应性调节:从停止浇水的植株上取叶片，撕取下表皮，在显微镜下观察并测量气孔孔径(同1)。4、气孔对CO2的反应:一投情况下，高CO2，抑制气孔张开，而低CO2诱导气孔开放，将盛有表皮条和少量水的小培养皿放在一盛有lNNaOH溶液的大培养皿中，用烧杯罩住，其中CO2被NaOH所吸收，放在室温、光照下30min ，处理前后测量气孔孔径。5 K+和Ca2+对气孔开闭的调节:一定浓度的K+促进气孔开放，Ca2+却促进气孔关闭。用pH6.1的10mM Tris

34、缓冲液配制不同浓度的K+ (1，10 、100mM )和Ca2(0.1，1、10Mm)溶液，放入表皮条，放在室温、散射光下2小时，测量各处理和对照的气孔孔径，作出浓度和孔径的关系图。6、气孔运动的激素调节:在一定条件下，一定浓度的IAA和CTK可促进气孔开放，而ABA诱导气孔关闭，和抑制气孔张开。用PH6.1的10mM Tris缓冲液配制不同浓度的IAA 、6-BA和ABA溶液（10-4、10-5和10-6M）,放入关闭的或开放的气孔的表皮条，在室温、散射光下2小时，测量各处理和对照的气孔孔径，作出激素浓度和孔径的关系图。六、实验结果计算与分析:将上述各处理的测定孔径结果求出平均值和标准差，全

35、班汇总进行统计，列表比较光暗、浇水和干旱、高低CO2等不同条件下气孔孔径的变化:分析K2和Ca2+对气孔孔径的影响;作图表明不同浓度激素对气孔运动的调节。思考题1、验中为什么用缓冲液配制各种处理溶液?2、说明K+气孔运动中的作用。3、设计实验进一步证明Ca2+在调节气孔运动中的作用。实验五、盐胁迫下植物体内保护酶(SOD、POD和CAT)活性的测定在正常环境中生长的植物体内代谢通常以较低的速率产生活性氧，产生的活性氧通常被自身的抗氧化系统所阻抑，但是一旦活性氧产生的量超过抗氧化系统所能消除的能力，就会发生氧化胁迫，从而导致胞质蛋白的损伤、DNA损伤和脂类过氧化。因此当植物的生存环境受到诸如干旱

36、、温度、空气污染、重金属、病虫害、土壤pH等的胁迫时，就会产生活性氧，活性氧产生量与抗氧化系统之间的平衡被打破时，导致活性氧上升，使植物产生损伤。活性氧的产生机理：活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）是泛指那些代谢过程中产生的含有氧原子、化学性质比氧更活泼的氧的衍生物。主要包括O2。、H2O2、OH、1O2，它们的产生几乎涉及需氧生物生化反应的主要领域，尤其是植物细胞的叶绿体、线粒体中ROS更易产生。植物逆境条件下通过SOD、CAT和POD同工酶的相互协调配合，可清除过剩的自由基，使体内自由基维持正常的动态平衡，提高植物的抗逆性。本实验研究盐胁迫下植物体内SOD、

37、CAT和POD活性变化，了解SOD、CAT和POD对高盐引发植物体内自由基毒害的保护作用机理。 材料：抗盐小麦品种：轮抗7（长势似乱发！）盐敏感小麦品种：品4100（长势整齐）材料的培育：温室盆栽，盐敏感和耐盐品种小麦，待小麦长至20cm高时，用150mMNaCl处理各品种小麦，并以不处理的小麦为对照。 每盆NaCl溶液体积为400ml，盐胁迫处理10小时。试剂：150mM NaCl：14.4g溶解在400ml dH2O中。 粗酶液提取： 取0.5g小麦叶片加入少量CaCO3和石英砂，用预冷的50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0，含1%PVP，0.1% 巯基乙醇）5ml于冰浴上研麿（研钵20

38、预冷却30min），定容至10ml，然后在04下离心（13,000g）20min，上清液即为酶提取液。离心完毕，用量筒定各上清液体积，倒入相应的小烧杯中，小烧杯放在冰浴中待测。试剂：200mM磷酸缓冲液(pH7.0)：800ml Na2HPO42H2O（358.14）500ml NaH2PO42H2O（156.01）500ml 50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：配500ml0.1% 巯基乙醇 1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）碳酸钙，石英砂设备：研钵 50ml带盖离心管 烧杯 量筒 移液器 天平 恒温水浴 冷冻高速离心机 紫外/可见分光光度计 制冰机 酸度计 磁力搅拌器千分之一天平SOD活性

39、测定-NBT法超氧化物歧化酶，简称SOD，首先在牛红细胞中发现，以后又在C3、C4植物细胞中发现。是一种广泛存在于动植物及微生物中的金属酶，主要有三种类型：Cu.Zn-SOD，分子量约为32KD，呈蓝绿色，由两个亚基组成，每个亚基含一个Cu和一个Zn，主要存在于真核细胞的细胞质和叶绿体内。Mn-SOD，呈粉红色，主要存在于原核和真核的线粒体中，原核线粒体中Mn-SOD分子量为4KD，由两个亚基组成，每个亚基含一个Mn；真核细胞线粒体的Mn-SOD分子量约为80KD，由4个亚基组成。Fe-SOD，呈黄色，只存在于真核细胞中，分子量约为38KD，由两个亚基组成，每个亚基各含一个Fe。此外在牛肝中还

40、存在一种Co.Zn-SOD。SOD的主要功能是特异性地催化超氧阴离子的歧化反应，即： SODO2-+ O2-+H+-H2O2+O2 对防止活性氧（包括O2-和.OH两种自由基）对机体的伤害及防御机体衰老有十分重要的作用，其活性测定也是根据这一反应进行。测定SOD的方法目前有三种：NBT光化还原法、超氧化钾直接测定法和邻苯三酚自氧化法。本实验采用的是第一种方法。一、 实验原理在氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基（O2.）。O2.可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2.，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后

41、，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。二、材料、仪器设备及试剂 (一)、试剂0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8，内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；130mmol/L 甲硫氨酸溶液：称1.399g甲硫氨酸，用磷酸缓冲液配制并定容100ml。750mol/L氮蓝四唑（NBT）：称0.06133g NBT，用磷酸缓冲液配制并定容至100ml，避光保存。100mol/L核黄素溶液：称核黄素0.0075g，用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存，现用现配，并稀释10倍。20mol/L EDTANa2（三）、步骤取透明度较好的试管2支，1支为测定，1支为对照，按下表加入相应试剂。混匀，其中一支

42、试管罩上黑纸，与其它各管同时置于4000lx日光灯下反应2030min，温度2535，反应时间视酶活而定，光照的样品至少需要稀释5倍。反应体系试剂名称用量（ml）终浓度0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L750mol/L NBT 溶液0.375mol/L100mol/LEDTANa2液0.310mol/L20mol/L核黄素0.32.0mol/L酶液0.1对照2支管以缓冲液代替蒸馏水0.5总体积3.3（四）、SOD活性测定与计算反应结束后，用锡纸罩上各试管，终止反应。分别在560nm波长下测定各管的吸光度，按下式计算SOD活性。（A0As）VT

43、SOD活性稀释倍数 A00.5WV1SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以u/mg。A0：对照的光吸光值；As：样品的吸光值；VT：样品总体积（ml）；V1：测定时样品用量（ml）；W：样品鲜重（g）。过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶是一种在自然界广泛存在的酶。pH值范围为4-9，最适pH值为7.0，最佳温度为37。冷冻和干燥与阳光和氧气一样都能降低酶的活性。过氧化氢酶催化分解过氧化氢生成氧和水,在240nm处光密度可以衡量反应混合物中过氧化氢含量降低的程度。试剂：CAT底物溶液：2%H2O2 50mmol/L磷酸缓冲液。步骤：1. 样品酶活性测定：用移液管将1ml底物溶液和1.9ml磷

44、酸缓冲液加入1cm比色皿，再加入0.1ml粗酶提取液，混匀，并在240nm处5分钟内测定光密度，每隔1分钟读一次数，直至每分钟的光密度降低量达到稳定为止。所测酶液至少需要稀释5倍。样品测定：底物溶液 0.2ml，磷酸缓冲液 2ml 加酶溶液 0.1ml 混合，测定。因只计吸光值的变化值，所以不需要对照。计算： 以每分钟变化0.0436为一个活力单位。E240样品所测体积样品稀释倍数1酶活力(U/g)=0.0436样品总体积样品重g式中： E240：240nm处每分钟内光密度的降低值（平均值）过氧化物酶活性的测定过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作、光合作用及生长素的氧化

45、等都有密切的关系，当植物受到环境胁迫时，酶活性就会发生变化。过氧化物酶催化过氧化氢生成水和氧。此反应中氢的供体是愈创木酚,它被氧化后成愈创木醌。用分光光度计在460nm处测定光密度。在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握常用的测定过氧化物的方法愈创木酚法。一、原理：在过氧化物酶（perosidase）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物的活性。二、 材料、仪器设备及试剂（一）、材料新鲜小麦叶片（二）、仪器设备722

46、型分光光度计，离心机，研钵，离心管，量筒，试管，吸管。（三）、试剂0.05mol/L pH7.0 磷酸缓冲液2% 愈创木酚溶液2%H2O2三、实验步骤（一）、过氧化物酶活性的测定酶活性测定的反应体系包括：2.9ml 0.05mol/L 磷酸缓冲液0.5ml 2% H2O2 0.1ml 2% 愈创木酚溶液 0.1ml 酶液因只计吸光值的变化值，所以不需要对照，直接在470nm波长下比色，每隔1min记录一次吸光度，共记录5次，再以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位（u）。四、结果计算以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）。 A470VT过氧化物酶活性(u/gmin

47、)WVs0.01t A470：反应时间内吸光度的变化；W：材料重（g）t：反应时间（min） Vs：测定时所取的酶液体积（ml）参考文献：1生化工艺学 陈来同，徐德昌 编著 2酶的测定方法 德 B.施特尔马赫 著 钱嘉渊 译3同工酶与植物遗传育种张伟强，唐秀芝 编著4许启新，余纪柱，陆世约，板田好辉 黄瓜苗期过氧化物酶活性的变化规律及其与抗枯 萎病的关系. 上海农业学报, 1994, 10(3):58-625邹国林，桂兴芬，钟晓凌等, 一种SOD的测定方法-邻苯三酚自氧化法的改进。生物化学与生物物理进展， 1986，4：71-736. XH 波钦诺克著，荆家海译，植物生物化学分析方法。科学出版

48、社， 1981，197-2017.张英竹叶提取物类SOD活性的邻苯三酚法测定。食品科学1997，18（5）：47498“中国期刊网”问题：1. 计算所测样品的酶活2. 试述SOD、CAT和POD在逆境胁迫中的作用。3. 影响SOD、CAT和POD活性测定的因素有哪些？试剂：150mmol/L NaCl：7.02g溶解在800ml dH2O中。200mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)：1000ml Na2HPO412H2O（358.14）：500ml 35.814g(约480ml) NaH2PO42H2O（156.01： 500ml 15.601g(约450ml，再用1N HCl调至7.0)

49、最后定容至1000ml。50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：500ml 取200mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)125ml，用ddH2O稀释至500ml。0.1%巯基乙醇：加500ul于500ml 50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）中。1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：称5g于上述500ml 50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）中。CAT底物溶液：用重蒸馏水将0.6 ml过氧化氢(30%H2O2)稀释至100ml。各组：研钵2/组，50ml带盖离心管4/组，烧杯4/组，量筒2/组，移液器200l/组，8支小试管，锡纸，8个1.5ml离心管。共用：1ml 移液器，200l，100

50、0l枪头具体：1150mmol/L NaCl 400ml2 1000ml 烧杯 1 个2200mmol/L NaH2PO42H2O 500ml 3. 200mmol/L Na2HPO42H2O 500ml500ml 烧杯 2 个，500ml试剂瓶2个4200mmol/L 磷酸缓冲液 800ml, 1000ml试剂瓶1个5100mmol/L、50mmol/L磷酸缓冲液各500ml, 500ml试剂瓶2个6重蒸水2升，大试剂瓶 1 个7CAT底物溶液100ml，82%愈创木酚液100ml,9. 0.5%过氧化氢溶液,100ml烧杯3个，试剂瓶3个10. POD底物200ml, 200ml烧杯1个，

51、试剂瓶1个。11量筒 50ml9个, 100ml3个, 5002个,1000ml1个，每班材料：抗盐和盐敏感各2盆实验六、盐胁迫对拟南芥盐敏感突变体生长的影响 拟南芥为十字花科植物，具有个体小、生长周期短、结实量大、易于栽培管理，基因组小、重复序列少、容易进行转化、易被诱变产生突变植株等生物学特性，尤其是拟南芥基因组全序列物理图谱已公布，使其成为模式植物被广泛地应用于植物生物学研究的各个领域。 采用物理、化学或遗传手段对拟南芥进行人工诱变，可获得含有大量突变体的突变体库。根据不同的筛选条件和筛选指标对突变体库进行筛选，获得所需的突变体, 并对其进行深入的生理、生化分析及基因克隆，是研究基因功能

52、的关键。目前已从拟南芥中筛选出了各种各样的突变体，并克隆了一些相应的基因，对这些基因的研究，为我们从分子生物学水平上理解植物的生长发育及调控机理以及植物适应外界环境条件的能力，提供了大量的信息。其中，调控拟南芥抗盐基因的克隆与研究，正是这些研究成果的一部分。 本实验选用sos1、 sos2、 sos3三个对盐敏感的拟南芥突变体，以根的向地性弯曲生长为指标，观察它们在含不同浓度NaCl的培养基上的生长情况并与野生型比较，学习拟南芥盐敏感突变体的筛选及鉴定方法，理解这些基因对植物抗盐的重要性。一、实验目的 1.掌握无菌条件下培养拟南芥幼苗的方法。 2.在含盐培养基上，观察不同浓度的盐胁迫对拟南芥盐敏感突变体生长的影响。 3.了解以根的向地性弯曲生长为指标，筛选、鉴定拟南芥盐敏感突变体的方法。二、实验原理 氯化钠可抑制植物的生长，植物生长受抑制的程度取决于NaCl的浓度。以拟南芥为例，较低浓度的氯化钠(如50mM NaCl)对野生型拟南芥的生长有轻微的抑制作用，但当氯化钠的浓度超过180mM时，可几乎完全抑制野生型拟南芥的生长。拟南芥的某些基因对其抗盐性具有重要作用，如果这些基因发