蛋白激酶MPK3MPK6调控拟南芥响应低温胁迫的分子机制

1、蛋白激酶MPK3/MPK调控拟南芥响应低温胁迫的分子机制 低温是重要的环境胁迫因素之一 , 影响植物的生长发育和地理分布。在长期 的进化过程中植物进化出一系列复杂而精密的响应机制来抵御低温胁迫造成的 伤害。低温信号能够迅速激活植物的冷响应信号通路 , 诱导下游冷响应基因的表达 , 调节植物体内的生理生化状态 , 从而增强植物对低温胁迫的耐受能力。近年来 , 关于植物响应低温信号分子机制的研究取得了很大的进展。其中研究比较清楚的是ICE1-CBF-C0R言号通路。植物感知低温信号后，能够 迅速诱导转录因子CBFs基因的表达,CBFs蛋白可以结合在下游冷响应基因 COR 启动子区保守的CRT/DR

2、E顺式作用元件,激活冷响应基因的表达,从而增强植物 的抗冻能力。CBFs基因受到上游关键的转录因子ICE1的直接调控。ICE1是一类MYCbHLH 型的转录因子 , 其蛋白的稳定性和转录活性受到一些蛋白的严风格控。E3泛素连接酶HOS可以泛素化ICE1蛋白,促进ICE1在低温下的降解;SUMOE连接酶SIZ1可以SUM化ICE1,增强ICE1蛋白的稳定性；JA信号途径 中关键的抑制因子JAZ1和JAZ4通过与ICE1蛋白互作影响ICE1的转录活性；另 外,蛋白激酶OST何以磷酸化ICE1,抑制ICE1与HOS的相互作用,从而增强ICE1 蛋白在低温下的稳定性和转录活性。 因此,ICE1蛋白翻译

3、后调控对其在功能的发 挥起着非常重要的作用。但是,目前尚不清楚ICE1蛋白在泛素化降解之前,是否受到其他蛋白的调控, 是否需要其他形式的修饰 ?本研究通过酵母双杂交技术筛选 ICE1 的互作蛋白 , 发 现两个与ICE1可以发生相互作用的蛋白激酶 MPK3和MPK6 MPK3和MPK6属于MAP蛋白激酶家族,位于MAP级联信号系统的下游。在拟南芥中,MAPKs一共有20个成员。Pull-down实验进一步验证了 MPK3/MPK与 ICE1蛋白在体外可以发生相互作用。免疫共沉淀实验证明MPK3/MPK与ICE1在植物体内存在于同一个蛋白复合 体中。冻处理表型分析发现，mpk3和mpk6功能缺失

4、突变体均表现出抗冻表型。在低温处理下,mpk3-2和mpk6-3缺失突变体中CBFs及其下游COR基因的表 达量明显高于野生型。因为 MPK3和MPK6是同源蛋白,在调控植物生长发育及响 应胁迫过程中具有类似的功能。因此，本研究利用NA-PP1诱导型mpk3 mpk6双突变体进行冻处理实验,结果 发现mpk3mpk6双突变体的两个株系MPK3SR#2和MPK3SR#6均表现出较强的抗 冻表型,并且CBFs及其下游基因的表达量要明显高于野生型。遗传分析证 明,mpk3 icel-2 和mpk6icel-2突变体表现出类似于icel-2 的冻敏感表型。基因表达分析发现，双突变体CBFs及其下游基因

5、的表达量明显低于野生型， 与icel-2 突变体中的表达量相当。以上结果说明，MPK3/MPK6通过与ICE1互作, 负调控其下游CBFs及 CORK因的表达，从而参与植物的低温响应。进一步的研究发现，MPK3/MPK可以在体外直接磷酸化ICE1。通过氨基酸序 列进行比对发现,ICE1有六个MAPI保守的磷酸化位点：Ser94、Ser203、Thr366、 Thr382、Thr384 和 Ser403。将 ICE1 蛋白六个磷酸化位点全部突变为 Ala, 获得非磷酸化形式的 ICE16A 蛋白,ICE16A在低温下的磷酸化程度明显弱于ICE1蛋白，说明低温诱导ICE1蛋 白的磷酸化很大程度上由

6、 MPK3/MPK蛋白介导。非磷酸化形式的ICE16A转入 icel-2 突变体后,转基因植株表现出比野生型更强的抗冻表型同时,MPK3/MPK磷酸化ICE1蛋白还影响其在气孔发育过程中的作用,plCE1:ICE16A-GFP植株气孔密度增加。以上结果说明,MPK3/MPK6介导的ICE1 磷酸化调控 ICE1 在低温信号和气孔发育过程中的作用。本研究还发现,ICE 1蛋白在mpk3和mpk6突变体中稳定性增强。ICE16A蛋 白在低温下的泛素化修饰减弱 , 导致其蛋白稳定性增强。但是,ICE16A与HOS蛋白的相互作用并没有受到影响。 另外，烟草瞬时表达 系统、ChIP和EMSAS验结果发现，MPK3/MPK釧制ICE1蛋白的转录活性;ICE16A 蛋白的转录活性明显增强。以上结果说明,MPK3/MPK介导的ICE1的磷酸化影响其蛋白在低温下的稳定 性和转录活性。综上所述,在拟南芥中,MPK3/MPK6是低温信号通路中重要的蛋白 激酶。MPK3/MPK通过磷酸化ICE1蛋白六个保守的磷酸化位点，抑制ICE1蛋白的 稳定性和转录活性，从而抑制CBFs基因的