细胞融合与单克隆抗体ppt课件

1、第四章第四章 细胞交融与单克隆抗体细胞交融与单克隆抗体第一节第一节 细胞交融概述细胞交融概述细胞交融细胞交融cell fusion)，又称体细胞杂交，又称体细胞杂交somatic hybridiazation，或细胞杂交，或细胞杂交cell hybridiazation，是指在离体条件下将不同种生物，是指在离体条件下将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞经过无性方式交融成一或同种生物不同类型的单细胞经过无性方式交融成一个杂合细胞的技术个杂合细胞的技术 。一、细胞交融的定义一、细胞交融的定义uMuller于1838年察看到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地交融产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1

2、858年描画了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞景象。uLuginbuhl于1873年察看到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个察看到脊椎动物蛙类的血液细胞发生交融的过程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并景象。u1958年日本学者冈田Okada发现仙台病毒具有触发动物细胞交融的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创建了聚乙二醇PEG化学交融法。u1975年Kohler和Milstein胜利地交融了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80

3、年代出现了电交融技术。二、细胞交融研讨进展二、细胞交融研讨进展生物种类生物种类细胞来源细胞来源胜利年代胜利年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙人胡萝卜番茄马铃薯人小鼠叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶腹水癌细胞原生质体叶根尖纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几

4、种细胞交融胜利的例子几种细胞交融胜利的例子植物交融细胞生长形状对比植物交融细胞生长形状对比,右瓶为地面交融的右瓶为地面交融的细胞，左瓶中为太空微重力环境下交融的细胞细胞，左瓶中为太空微重力环境下交融的细胞 动物细胞交融实验运用的小白鼠动物细胞交融实验运用的小白鼠 三、动植物细胞的交融过程三、动植物细胞的交融过程植物细胞交融过程植物细胞交融过程人造小鼠培育过程表示图人造小鼠培育过程表示图四、细胞交融的意义四、细胞交融的意义u实际上说任何细胞，都有能够经过体细胞杂交而成为新的生物资源。这实际上说任何细胞，都有能够经过体细胞杂交而成为新的生物资源。这u 对于种质资源的开发和利器具有深远的意义。对于种

5、质资源的开发和利器具有深远的意义。u交融过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间交融过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间u 的遗传物质交换提供了有效途径。的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分u 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生亦可发生重组，从而产生新新 u 的核外遗传系统。的核外遗传系统。u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。第二节第二节 细

6、胞交融的根本原理细胞交融的根本原理显微镜下细胞交融过程显微镜下细胞交融过程交融过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂构成细胞桥的变化过程图解交融过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂构成细胞桥的变化过程图解用灭活的病毒诱导的动物细胞交融过程表示图用灭活的病毒诱导的动物细胞交融过程表示图 第三节第三节 细胞交融的常用方法细胞交融的常用方法一、仙台病毒法一、仙台病毒法仙台病毒诱导细胞交融经四个阶段：仙台病毒诱导细胞交融经四个阶段： 两种细胞在一同培育，参与病毒，在两种细胞在一同培育，参与病毒，在4条件下病条件下病毒附着毒附着 在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚； 在在37中，病毒与

7、细胞膜发生反响，细胞膜遭到中，病毒与细胞膜发生反响，细胞膜遭到破环，此破环，此 时需求时需求Ca2+和和Mg2+，最适，最适PH为为8.0一一8.2； 细胞膜衔接部穿通，周边衔接部修复，此时需细胞膜衔接部穿通，周边衔接部修复，此时需Ca2+和和 ATP； 交融成宏大细胞，仍需交融成宏大细胞，仍需ATP 。病毒促使细胞交融的主要步骤如下：病毒促使细胞交融的主要步骤如下： 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此接近；两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此接近； 经过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜经过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间相互浸透，胞质相互浸透；间相互浸透，胞质相互浸透

8、； 两个原生质体的细胞核相互交融，两个细胞融为一两个原生质体的细胞核相互交融，两个细胞融为一体；体； 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。的杂种细胞。用灭活的病毒诱导的动物细胞交融过程表示图用灭活的病毒诱导的动物细胞交融过程表示图 u 优点是易得，用法简单，交融效果稳定。优点是易得，用法简单，交融效果稳定。u聚乙二醇聚乙二醇(PEG)构造为：构造为：HOH2CCH20CH2nCH2OH，分子量大，分子量大于于u 200小于小于6000者均可用作细胞交融剂。者均可用作细胞交融剂。uPEG浓度以浓度以W/W；如将；如将10克克PEG与

9、与10mlEagLe氏液混合假定氏液混合假定1mlu 培育液为培育液为1g重重)，即成，即成50PEG溶液。溶液。uPEG经高压灭菌后，与温热的经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。氏液混合。u通常用分子量低于通常用分子量低于1000的的PEG作交融剂最好，作交融剂最好，50PEG溶液能产生溶液能产生u 最多杂交细胞。最多杂交细胞。uPEG溶液在溶液在pH6.0时细胞交融率最高。时细胞交融率最高。二、聚乙二醇二、聚乙二醇PEG法法聚乙二醇聚乙二醇PEG法细胞交融过程法细胞交融过程PEG的作用机理：的作用机理： Kao等以为，由于等以为，由于PEG分子分子具有细微的负极性，故可以与具有正极性

10、基团具有细微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等构成的水、蛋白质和碳水化合物等构成H键，从而键，从而在在质膜之间构成分子桥，其结果是使细胞质在在质膜之间构成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的交融；另外，膜发生粘连进而促使质膜的交融；另外，PEG能添加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞能添加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生交融成为能够。器发生交融成为能够。 PEG诱导交融的特点：其优点是交融本钱低，勿诱导交融的特点：其优点是交融本钱低，勿需特殊设备；交融子产生的异核率较高；交融过需特殊设备；交融子产生的异核率较高；交融过程不受物种限制。其缺陷是交融过程

11、繁琐，程不受物种限制。其缺陷是交融过程繁琐，PEG能能够对细胞有毒害。够对细胞有毒害。聚乙二醇聚乙二醇PEG法细胞交融步骤法细胞交融步骤1将两种不同亲本细胞各将两种不同亲本细胞各5l06混匀；混匀；2离心沉淀，吸去上清液；离心沉淀，吸去上清液；3加加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触使之与细胞接触1分钟；分钟；4加加9ml 培育液，离心沉淀，吸去上培育液，离心沉淀，吸去上清液；清液；5加加5ml 培育液，分别接种培育液，分别接种5个直径个直径60mm平皿，每个平皿加培育平皿，每个平皿加培育 液至液至 5ml，37的的CO2培育箱中培育箱中培育。培育。6624小

12、时后，换成选择培育液挑选小时后，换成选择培育液挑选杂交细胞。杂交细胞。三、电交融法三、电交融法 电交融法是80年代出现的细胞交融技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜外表的氧化复原电位发生改动，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开场衔接，直到闭和成完好的膜，构成交融体。电交融法的优点：交融率高、反复性强、对细胞损伤小；安装精巧、方法简单、可在显微镜下察看或录像察看交融过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。电交融的根本过程：电交融的根本过程：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即经过原生质体而不是

13、经过溶液，其结果是场通电后，电流即经过原生质体而不是经过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体严密接触陈列成串；严密接触陈列成串；膜的击穿：原生质体成串陈列后，立刻给予高频直流脉冲就膜的击穿：原生质体成串陈列后，立刻给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个严密接触的细胞交融在可以使原生质膜击穿，从而导致两个严密接触的细胞交融在一同。一同。 电交融诱导法原理表示图电交融诱导法原理表示图第三节第三节 杂种细胞的挑选杂种细胞的挑选根据曾经发生交融的细胞中所含有核的类型，可将其根据曾经发生交融的细胞中所含有核的类

14、型，可将其分为以下几种类型：分为以下几种类型：异核细胞：非同源细胞的交融体。异核细胞：非同源细胞的交融体。同核细胞：两个一样细胞的交融体。同核细胞：两个一样细胞的交融体。多核细胞：含有双亲不同比例核物质的交融体。多核细胞：含有双亲不同比例核物质的交融体。u基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种挑选u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种挑选u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的挑选u具有所需性状杂种细胞的挑选常用的杂种细胞挑选方法常用的杂种细胞挑选方法第四节第四节 细胞杂交瘤技术与单克隆抗体细胞杂交瘤技术与单克隆抗体一、何谓单克隆抗体？一、何谓单克隆抗体？只针对某一抗原决议簇的抗体分子称为单克隆抗体。只针

15、对某一抗原决议簇的抗体分子称为单克隆抗体。 单克隆抗体技术的中心是用骨髓瘤细胞单克隆抗体技术的中心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与与经特定抗源免疫刺激的经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)交融得到杂交瘤细胞交融得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细淋巴细胞产生特异性抗体的才干。因此，单克隆抗体技术又称为杂胞产生特异性抗体的才干。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术交瘤技术(hybridoma

16、 technology 。Niels K. Jerne G. Kohler C. Milstein 二、杂交瘤技术的根本原理二、杂交瘤技术的根本原理三、杂交瘤细胞的制备三、杂交瘤细胞的制备一骨髓瘤细胞选择及选择性培育基一骨髓瘤细胞选择及选择性培育基骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型HGPRT-胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型TK-HAT培育基培育基次黄嘌呤hypoxanthine，H氨基喋呤aminopterin， A胸腺嘧啶脱氧核苷thymidine， T次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷

17、型次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型HGPRT-胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型TK-二免疫小鼠二免疫小鼠 免疫程序是取68周龄BalbC雌鼠，根底免疫2周，静脉再加强免疫一次，35天后用于交融。免疫时能否采用佐剂和事先处置抗原，要依抗原性的强弱而定。普通来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为loog，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1l06一1107。三脾细胞的制备三脾细胞的制备(1)(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；(2)(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔

18、组织和脂肪，用无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml5ml无血清培育液冲洗一次；无血清培育液冲洗一次；(3)(3)把脾脏置于已消毒的把脾脏置于已消毒的9090一一100100目不锈钢网或尼龙纱网中；目不锈钢网或尼龙纱网中；(4)(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端悄然压挤，再用无血清培育液冲洗，在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端悄然压挤，再用无血清培育液冲洗， 令细胞经过纱网，搜集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入令细胞经过纱网，搜集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml3ml无血清培育无血清培育 液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；液，反复抽吸数次方法获取细胞，

19、再制成细胞悬液亦可；(5)(5)把细胞悬液注入把细胞悬液注入50ml50ml离心管中，加离心管中，加l0l0一一20ml20ml培育液：悄然吹打数次，室温中培育液：悄然吹打数次，室温中 置置5 5分钟；分钟；(6)(6)离心离心(800(800一一10001000转分转分) )计数、备用。计数、备用。四细胞预备四细胞预备1 1搜集骨髓瘤细胞，用无血清培育液洗搜集骨髓瘤细胞，用无血清培育液洗3 3次次(37)(37)，计数活力细胞，计数活力细胞( (不少于不少于9090) )；2 2搜集小鼠脾细胞，用无血清培育液洗搜集小鼠脾细胞，用无血清培育液洗3 3次次(37)(37)，并计细胞数和测定活力细

20、胞；，并计细胞数和测定活力细胞；3 3按按1 1：5 5或或1 1：1010混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤 纸吸纸吸 净多余上清。净多余上清。五细胞交融五细胞交融(1)将1ml 40的PEG液一滴滴参与列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断细微 转动离心管或用手指轻弹离心管；(2)在不断转动离心管中加1ml无血清培育液，60秒钟内加完；(3)于5分钟内渐渐加完20ml无血清培育液；此时细胞对机械损伤非常敏感，(4)离心(800转分，8分钟)，去上清，用完全培育液10ml悬浮，悄然混匀；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取

21、等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5CO2，温箱中37培育，24小时后改换成HAT选择性培育掖。六交融后细胞培育六交融后细胞培育(1)交融后710天用HAT培育液半量换液(留一半旧的加一半新的) 后每隔23天 半量换液一次；(2)两周后可改用HA培育液半量换液，或仍用HAT培育液；(3)23周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；(4)待集落增殖生长至13孔时，应进展抗体检测。HAT培育基培育基次黄嘌呤hypoxanthine，H氨基喋呤aminopterin， A胸腺嘧啶脱氧核苷thymidine， T次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型

22、HGPRT-胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型TK-七抗体检测七抗体检测免疫荧光实验放射免疫实验(RIA)联免疫吸附实验(ELISA)八单克隆抗体的大量制备八单克隆抗体的大量制备体内法体内法培育法培育法四、单克隆抗体的运用四、单克隆抗体的运用单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病 诊断，以提高疾病诊断的准确性。诊断，以提高疾病诊断的准确性。利用单克隆抗体技术可以消费各种免疫疫苗，这不仅能大大降低消费成利用单克隆抗体技术可以消费各种免疫疫苗，这不仅能大大降低消费成 本，同时也添加了疫苗的平安性。本，同时也添加了疫苗的平安性。单克隆抗体还有能够用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症非