小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)说明书

1、小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的活性。实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)水平。用纯化的小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，再与HRP标记的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作

2、用下转化成最终的黄色。颜 色的深浅和样品中的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，通过标准曲线计算样品中小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)浓度。试剂盒组成试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份圭寸板膜2 片(48)2 片(96)密封袋1个1个酶标包被板1X 481X 962-8 C保存标准品：135U/L0.5ml X 1 瓶0.5ml X 1 瓶2-8 C保存标准品稀释液1.5ml X 1 瓶1.5ml X 1 瓶2-8 C保存酶标试剂3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存样品稀释液3 ml X 1 瓶6

3、 ml X 1 瓶2-8 C保存显色剂A液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存显色剂B液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存终止液3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存浓缩洗涤液(20ml X 20 倍)X 1 瓶(20ml X 30 倍)X 1 瓶2-8 C保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细

4、收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次 离心。3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS （ PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一

5、定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8 C的温度。加入一定量的PBS （ PH7.4）,用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。分装后一份待 检测，其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于 -20 C保存，但应避免反复冻融 .7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤：1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100门然后在第一、第

6、二孔中加标准品稀释液50卩,混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100卩1分别加到第三孔和第四孔， 再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50卩, 混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取501弃掉，再各取50卩1分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50卩,混匀后从第七、第八孔中分别取50卩1加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50卩,混匀后从第九第十孔中各取50卩1弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50卩,浓度分别为 90U/L， 60U/L ， 30U/L，

7、15 U/L，7.5 U/L）。2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40卩,然后再加待测样品10卩1（样品最终稀释度为 5倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后置 37 C温育30分钟。4. 配液：将 30（ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30（ 48T 的 20 倍）倍稀释后备用。5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50 ,空白孔除外。7

8、. 温育：操作同 3。8. 洗涤：操作同 5。9. 显色：每孔先加入显色剂 A501,再加入显色剂 B501,轻轻震荡混匀，37C避光显色 15分钟.10. 终止：每孔加终止液 50卩终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（ OD值）。测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。注意事项：1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样

9、时间最好 控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本0D值大于标准品孔第一孔的 0D值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（X nx 5）。5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6. 底物请避光保存。7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准&所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9. 本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。（此图仅供参考）计算：以标准物的浓度为横坐标， 0D值为纵坐标，在坐标纸

10、上绘出标准曲线，根据样品的0D值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 0D值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的0D值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。试剂盒性能：1样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。2批内与批见应分别小于 9%和15%检测范围：3 U/L -100 U/L保存条件及有效期：1.试剂盒保存：;2-8Co2 有效期：6个月FOR RESEARCH USE ONLYMouse Phosphorylatedade nosinemon ophosphate activated prote inkin aseDr

11、ug NamesGenericName： Mouse Phosphorylated adenosine monophosphate activated protein ki nase(AMPK)ELISAKit.PurposeThiskit allowsfor the determinatioof AMPKin Mouseserum,bloodplasma,andother biologicafluids.Principle of the assayThe kit assayMouseAMPKlevel in the sample, use PurifiedMouseAMPKto coat m

12、icrotiterplate wells, make solid-phasea ntibodythe nadd AMPKto wells, Combi nedAMPK which With HRP labeled , becomeantibody_ antigen- enzyme-antibodyomplex,after washi ngCompletelyAddTMBsubstratesolutio n,TMEsubstratebecomesblue color At HRP en zyme-catalyzedeactionis term in atedby the additi onof

13、a sulphuricacidsoluti onan dthe color change is measured spectrophotometricallyit a wavelengthof 450 nm. The concentrationof AMPKin the samplesis then determinedby comparingthe O.D. of the samplestothesta ndaroburve.Materials provided with the k itMaterialsprovidedwith thekit48determinations96determ

14、inationsStorageUsermanual11Closureplatemembrane22Sealedbags11Microelisastripplate112-8CStandard：135U/L0.5ml xbbttle0.5ml xbbottle2-8CStandarddiluent1.5ml xbbttle1.5ml xbbottle2-8CHRP-Conjugatreeagent3ml x bottle6mlxbbottle2-8CSamplediluent3mlx bbottle6mlxbbottle2-8CChromogenSolutionA3mlx bbottle6mlx

15、bbottle2-8CChromogenSolutionB3mlx bbottle6mlxbbottle2-8CStopSolution3mlx bbottle6mlxbbottle2-8C( 20ml x 20 fold)( 20ml x 30 fold)2-8Cwash solutionx1bottlex1bottleSpecimen requirements1. serum-coagulationat roomtemperature10-20mins，centrifugation20-minat the speedof 2000-3000r.p.m.removesupernatantI,

16、f precipitationappearedC, entrifugaal gain.2. plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20 mins ,centrifugation20-min at the speed of 2000-3000r.p.m. remove supernatant,If precipitationappeared,Centrifugaal gain.3. Urine-collectsuea sterilecontainer,centrifugation20-minat t

17、hespeedof 2000-3000r.p.m. remove supernatant,If precipitationappeared, Centrifugal again. The Operation of Hydrothoraxand cerebrospinafluidReferenceto it.4. cell culture supernatant-detect secretorycomponents,collect sue a sterile container, centrifugation20-min at the speed of 2000-3000r.p.m. remov

18、esupernatant,detectthe compositionof cells,Dilutcell suspensionwith PBS( PH7.2-7.4) , Cell concentration reached 1 million / ml, repeated freeze-thawcycles, damage cells and release of intracellularcomponents,centrifugation20-minat the speedof 2000-3000r.p.m.remove supernatantI,f precipitationappear

19、ed,Centrifugaal gain.5. Tissuesamples- Aftercuttingsamples,checkthe weight,addPBS(PH7.2-7.4) , Rapidly frozenwithliquidnitrogenmaintainsamplesat2-8C aftermelting,addPBS (PH7.4 , Homogenizedby handor Grinders,centrifugation20-minat the speedof 2000-3000r.p.m. removesupernatant.6. extract as soon as p

20、ossibleafter Specimencollection,andaccordingto the relevant literature,and shouldbe experimentas soonas possibleafter the extraction.If it can t, specimemanbekeptin -20 C topreserveAvoidrepeatecfreeze-thawcycles.7. CandtetectthesamplewhichcontainNaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.Assay procedure1. Di

21、luteandaddsampletoStandard:set10StandardwellsontheELISAplatescoated,addStandard100 ytothefirstandthesecondwell,thenaddStandarcdilution50 ytothefirstand the sec on dwell,mix;take out100 yfbrmthe firsta nd the sec on dwellthe n add it to the third and the forth well separatelythen add Standarddilution

22、50 卩 to the third and the forth well,mix; the ntakeout50 yfromthethirda ndtheforthwelldiscard,add50(ito the fifth a nd thesixthwell,the naddSta ndarcdilution50(ito the fifth a ndthesixthwell,mix; takeout 50 卩1 fromthefifthandthesixthwellandaddtotheseventhandtheeighthwell,thenaddStandard diluti on50

23、ytbtheseve ntha ndtheeighthwell,mix; takeout 50 ytTomtheseve ntha nd the eighthwella ndaddtothe nin tha ndthete nthwell,addSta ndarcdilution50 yto the nin th a nd thetenthwell,mix, takeout50yfromtheninthandthetenthwelldiscard(addSample50yto eachwellafterDiluting,(density:90U/L，60 U/L ，30 U/L ， 15 U/

24、L ， 7.5 U/L)2. addsample：Setblankwellsseparately(blankcomparisonwellsdonatddsampleandHRP-Conjugatreeagent,othereachstepoperationissame).testingsamplewell.addSample dilution40yto testingsamplewell,thenaddtestingsample10y(samplefinaldilutionis 5-fold),addsampletowells, dontotuchthewellwallasfaraspossi

25、ble,andGentlymix.3.IncubateA: fterclosingplatewithClosureplatemembrane,incubatefor30 minat37C .4. Configurateliquid:30-fold(or20-fold)washsolutiondiluted30-fold(or20-fold)withdistilled waterandreserve.5. washing：UncoverClosureplatemembraned, iscardLiquid,drybyswing,addwashingbuffer toeverywell,still

26、for30sthendrain,repeat5times,drybypat.6. addenzyme：AddHRP-Conjugatreeagent50ytoeachwell,except blankwell. 7.incubate：Operationwith3.8. washing：Operationwith5.9. color： Add ChromogenSolutionA 50ul and ChromogenSolutionB to each well,evadethelightpreservatioifor 15 min at37ClO.Stopthe reaction Add Sto

27、p Solution50 tceach well, Stop the reaction(thdolue color changetoyellowcolor).11.assay：takeblankwellaszero, Readabsorbanceat450nmafterAddingStopSolutionand within15min.Important notes1. Thekittakesoutfromtherefrigerationenvironmensthouldbebalanced15-30minutesin theroomtemperatureE, LISAplatescoated

28、if hasnotuseup afteropened,theplateshould bestoredin Sealedbag.2. washingbufferwill Crystallizationseparation,it canbe heatedthe waterhelps dissolve whendilute. Washingdoesnotaffecttheresult.3. add Samplewith samplerEach step,And proofreadits accuracyfrequently,avoidsthe experimentalerror. add samplewithin 5 mins, if the numberof sampleis much , recommendtouseVolley.4. ifthetestingmaterialcontentisexcessivelyhigher(ThesampleODisbiggerthanthefirst standardwell),pleasediluteSample(n-fold),Pleasediluenteandmultipliedbythedilution factor, x n)5