(完整版)Sanger测序流程

1、Sanger测序一、原理Sanger法测序是利用一种DNA聚合酶 来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A 、T 或 C 处终止并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A 、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE 胶上电泳进行检测， 从而获得可见的DNA碱基序列 。ABI 3730XL测序仪 是高质量的长片段读取和序列分析的

2、测序平台，应用灵活而广泛，可同时分析96个样品 。该仪器 采用 4 色荧光同时检测 ，可不间断 24 小时运行， 自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析 。二、技术路线三、操作流程1 、DNA 的提取一般采用试剂盒提取（参考试剂盒提供的protocol）。2 、PCR 扩增与电泳 配置 PCR 体系（ 25ul体系）DNA 浓度大于 30ng/ul（DNA 浓度需要测定）:试剂名称用量H2O15.2 l10*PCR buffer2.5l2.5Mm dNTPs3lprimer（前后引物各1ul ）2lLA Taq酶0.3lDNA模板2l注意 :对于CEBPA 和NOTCH1此类 GC 含量高的

3、将10*PCR buffer2.5ul 换为2*GC buffer12.5ul , H2O为 5.2ul 。每次 96 孔板加样后都必须贴封口膜，离心混匀（2000g 1min）, 防止挂壁。 EP 管与 96 孔板等都为商品型一次性产品, 注意标记板号, 样本号和引物号。 设置 PCR 反应程序一般程序： 96 预变性2min, 96 30s, 57 30s, 72 2min, 35cycles; 72延伸 5min; 4 /15 。CEBPA 和 NOTCH1程序： 96 预变性5min, 95 40s, 64 /66 40s, 72 1min, 35cycles; 72延伸 5min;

4、4 /15 。 琼脂糖凝胶电泳配置 1.5% （ 60ml 0.9g,大胶板 150ml 2.25g）的琼脂糖凝胶, 再分别取 2ul loading buffer与 4ul DNA扩增产物混合后进行电泳, 160V 35min。3 、PCR 产物纯化 配制消化液TaKaRaAlkaline Phosphatase虾碱酶0.5lTaKaRaExonuclease I 外切酶0.5l配置消化液 , 分别取虾碱酶与外切酶1:1 混合。 PCR 产物离心后，每个孔中加入1 l以上消化液到 PCR 反应液中。 纯化反应： 上 PCR 仪进行程序反应。程序为 SAP: 37 60min, 80 15mi

5、n, 4 /15 。4 、测序反应 SEQ MIX 配置试剂：ABI PRISM? BigDye? Terminator v3.1 cycle Sequencing Kit根据 PCR 反应的数量按照下表配制MIX ：试剂名称用量BigDye0.4lSequencing Buffer0.8lH2O1.8lPrimer （ 3.2pmol/ l ）（引物可单加）1 l模板（即 3- 中的产物）1ul按照测序反应表在96 孔板中加入3 l以上 MIX ， 1 l对应引物， 1 l对应 PCR 产物（注意封膜后要求压膜） ,离心。（测序反应只有一个引物，为避免加样过程中的液体消耗，体系需要超量配置）

6、。 SEQ 程序 : 96 预变性 2min, 96 10s, 55 5s, 60 90s, 25cycles; 4/15 。5 、纯化此步骤是将测序反应体系中除目标单链核酸片段之外的杂质尽可能去除, 以减少 ABI 3730毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。 试剂准备：0.125 mol/L EDTA-Na2溶液：称取2.325g EDTA-Na22H2O于 50ml离心管中，加入40ml去离子水，65 水浴加热，间歇振荡几次至完全溶解，用去离子水定容至50ml，振荡10秒混匀。无水乙醇（优级纯）去离子甲酰胺HIDI 将无水乙醇与蒸馏水混合配制成85% 乙醇， 70% 乙醇，当天使用。 测序

7、反应板离心后，每个反应孔加入EDTA-Na2溶液 2.5 l ，85% 乙醇 40 l ，充分震荡3min ，离心3000g ，4 ，30min （ EDTA 作为金属离子螯合剂, 能与测序PCR 反应体系中的离子结合从而去除离子） 离心结束后将测序反应板倒置于吸水纸上，倒离心至离心力达到185g （或 900rpm）时立即停止。 每孔加入 70% 乙醇 50 l ，充分震荡1min ，离心 3000g ，4， 15min （DNA 片段在 70% 的乙醇中溶。解度低 , 能通过离心沉淀下来）。 重复4步骤。 避光风干 1530min ，每孔加入 10 l HIDI（变性处理， 生物安全柜中进

8、行） ，离心后在 PCR 仪中 96 反应 2min ，降温至 4 后取出。6 、上机测序变性结束后，上测序仪（ABI 3730 ）进行测序。1. 创建样品板程序 选择 GA Instruments ga3730 Plate Manager； 点击 New 按钮，弹出的 New Plate Dialog窗口中填写相应的内容（在ID 和 Name空白栏中输入样品板的名字 ; 在 Application 中选择相应的测序程序; 在 Plate Type中选择 96 或者 384 孔板 ; 在Scheduling 中定义取样顺序 ; 在 Plate Sealing中选择 Septa; 在 Owner

9、 Name 、 Operator Name中输入操作者。 点击“ OK ”按钮 ; 在弹出的 Sequencing Analysis Plate Editor窗口中 , 填入相关的内容（在SampleName 中填入样品名 , 96孔板在 A01 行填写“ 1 ”， 384 孔板依次在A01 、 B01 、A02 、B02 行写 1、 2 、3、 4；在 Results Group 1栏中选择数据上传路径; 在 Instrument Protocol 1栏中选择测序程序 ; 在Analysis Protocol 1栏中选择数据分析程序）。 然后全选 A01行，点击 Edit Fill Down

10、 Special,选中 Fill Down Special (96 Cap),将自动生成 96行; 如果是 384 孔板 , 依次全选A01 、A02 、B01 、B02 行，重复4 次操作 , 点击“ OK ” 。2. 载入样品板拉出样品栈 , 打开进样栈门 ;放入样品板（顺序自下到上排列待上机）,注意缺角方向 ;关上进样栈门, 将载样栈推回原处。3. 调用上机程序选择GA Instruments GA 3730 Instrument Name Run Scheduler。点击Search按钮 ,在弹出的Add Plate to In Stack窗口中输入样品板名, 点击Search按钮，选中相应的样品板名,点击Add按钮