Co-IP原理与方法(共9页)

1、免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀

2、实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复基本实验步骤(1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4裂解30min， 12,000g离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1g相应的抗体和10-50 l protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4C缓慢摇晃孵育过夜；(3）免疫沉淀反应后，在4C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗34次；

3、最后加入15l的2SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4完成外，最为关键的是裂解液的成份。用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂

4、解液为例（主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCl，一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。a缓冲液：离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。b NaCl浓度一般习惯用150 mM，这主要是因为150 mM接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的，局部NaCl的浓度可以低到50 mM，150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。c甘

5、油由于其粘性，可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。d裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细胞器的膜，从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶，通过Protease Cocktail（多种蛋白酶抑制剂混合物）可以抑制蛋白酶。e去垢剂对于免疫沉淀实

6、验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果：- 细胞质/器膜的通透性：因为许多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释放出来，抗体才能与之反应。- 膜蛋白的释放：许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。- 蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测，所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种

7、类和浓度。二、抗体-agarose beads孵育裂解细胞，离心并去除不可溶的膜组份后，上清可以储存在-80保存3个月，但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜，也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白（1mg/ml）对应添加1 ug抗体，最高可以添加至5 ug抗体，过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG，但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。

8、例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，选择膜蛋白B来做阴性对照，只要确认二者之间没有相互作用；而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀，则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时，为避免Protein A或者G beads有（非）特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性，一般在加入目的蛋白抗体之前，预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时，然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。同时，Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和Ig亚型，选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推

9、荐使用Protein A和Protein G beads的混合物，这样可以达到最佳实验效果，而且省去了许多选择的烦恼。三、抗体-agarose beads复合物洗涤：除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方，但去除甘油，以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求，还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例，种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考

10、虑使用低浓度（0.2-0.5%）的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、鉴定免疫沉淀实验用途非常广泛（见IP： Q&A），而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段（比如免疫共沉淀，染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀），因此，免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育，因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后，eppendorf管中主要含有抗体，目的蛋白

11、，Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中，抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起，只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此，最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子（55KD）和轻链分子（25KD）。因此，WB显色反应中

12、除了能检测到目的蛋白外，如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话，还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大（1ug），所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。针对上述情况，通常有二种解决办法：a选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验，就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。b使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agaros

13、e beads复合物，最后离心去除抗体-agarose beads复合物，上清中只留下目的蛋白。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质是否在生理条件下有相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprec

14、itation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它的基本原理是在生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联在一起，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断进行PCR检测，可以知道目的蛋白与那些基因作用。RNA免疫沉淀是研究体内RNA与蛋白质相互作用的重要手段。它的基本原理是在生理状态下针对可以结合RNA的蛋白质进行免疫沉淀，然后通过分离抗体-Protein A/G beads复合物中的RNA成份，最后通过基因芯片或者其它手段检测目的RNA。由此可见，CO-IP和CHI

15、P以及RIP都是基于IP的基本原理去实现不同的研究目的，CO-IP主要是研究目的蛋白X和与之发生相互作用的蛋白Y之间的作用关系；而CHIP主要是研究目的蛋白X和与之发生相互作用的DNA片段Y之间的作用关系；RIP主要是研究RNA结合蛋白和RNA之间的结合。这也就决定了在进行IP，CO-IP和CHIP以及RIP实验时时操作步骤和涉及的缓冲液配方都有所不同。 免疫沉淀：因为免疫沉淀的目的主要是通过抗体和目的蛋白相互作用从而捕获目的蛋白，所以实验中要注意的关键点是抗体和目的蛋白相互作用的效果。其主要受抗体的结合能力，目的蛋白和抗体的可接触性两个因素影响。所以免疫沉淀实验中的关键因素是抗体的选择以及裂

16、解缓冲液中的配方。对于前者而言，抗体所针对的作用表位必须处于目的蛋白表面，对抗体结合力的要求和免疫印迹或者免疫荧光相比要高得多；对于后者而言，主要考虑因素是缓冲液中的去垢剂成分能否在不破坏目的蛋白天然构象的情况下（不影响目的蛋白和抗体的相互作用效果）将目的蛋白从细胞局部定位（比如位于某些细胞器中）中有效释放出来。免疫共沉淀：免疫共沉淀的目的是通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获目的蛋白复合物，最终检测目的蛋白复合物中各成分之间的相互作用。所以实验中要注意的关键点和免疫沉淀相比，除了要注意抗体和目的蛋白相互作用的效果外，还要注意目的蛋白复合物的完整性。后者主要考虑因素是缓冲液中的去垢剂成分能否在

17、有效释放目的蛋白复合物进入可溶相的情况下不破坏目的蛋白复合物中各成分之间的相互作用。所以，免疫共沉淀实验中的关键因素除了抗体的选择外，裂解缓冲液配方中的去垢剂的成分和浓度对免疫共沉淀实验的成功与否至关重要，其选择相比免疫沉淀实验而言，要求更严格。染色质免疫共沉淀：染色质免疫沉淀的主要目的通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获和目的蛋白有相互作用的DNA片段，最终检测目的蛋白和DNA片段的相互作用。因此，实验中要注意的关键点和前二者（免疫沉淀和免疫共沉淀）有所不同。因为在实验中中蛋白质-DNA复合物的维持需要依靠多聚甲醛的交联作用，所以目的蛋白的许多表面表位也在交联过程中丧失。因此，除了后续的基本

18、操作和免疫沉淀以及免疫共沉淀有些许不同，有额外需要注意的是向外，其对抗体的要求要比免疫沉淀和免疫共沉淀高得多，相对而言，裂解缓冲液的成份并不是关键因素。 免疫共沉淀实验由于在非变性实验条件性进行，这样蛋白质之间的天然相互作用得以最大程度的保留，因此可以比较真实的反应蛋白质之间的相互作用。但也基于此点，免疫共沉淀并不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的，因为通过目的蛋白抗体共沉淀下来的是一个蛋白复合物，而不仅仅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。而GST-Pull down实验可以通过体外实验条件，去除其它蛋白的影响，从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。实验名称研究目的研究用

19、途备注免疫沉淀研究目的蛋白的理化特性蛋白纯化利用抗体和抗原的特异性结合达到纯化抗原的目的去除目的蛋白利用抗体和抗原的特异性结合达到从含有抗原的反应液中去除优化免疫印迹（WB）效果通过IP可以对目的抗原进行富集（最高可以富集10，000倍），然后进行WB。由于对目的抗原进行了富集，提高了抗原浓度，这样可以解决许多抗体WB实验效果不好（包括特异性不好和背景严重）的问题测定蛋白修饰位点信息可以通过免疫沉淀纯化抗原去进行质谱鉴定从而测定蛋白的修饰位点的信息（磷酸化，甲基化，乙酰化和糖链修饰等）测定蛋白的降解速度通过免疫沉淀纯化经由放线菌酮处理的细胞样品中的抗原再通过WB测定不同样品中目的抗原的含量；或

20、者对细胞进行同位素脉冲标记然后进行免疫沉淀实验再通过放射自显影测定目的抗原的含量测定酶活经免疫沉淀纯化待测酶后再进行酶活测定（包括激酶测定等）免疫共沉淀研究蛋白与蛋白的相互作用寻找新的相互作用蛋白经由免疫共沉淀然后通过质谱或者WB鉴定新的相互作用蛋白验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用经由免疫共沉淀然后通过使用待测蛋白的抗体进行WB实验可以确定目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用染色质免疫沉淀研究蛋白与DNA的相互作用研究蛋白与DNA的动态作用通过对经由免疫共沉淀而得到的DNA片段进行PCR实验可以获得DNA片段的序列信息以及目的蛋白与DNA之间的动态作用信息研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间

21、的关系通过使用针对组蛋白不同修饰位点的抗体进行染色质免疫沉淀实验去检测组蛋白的不同修饰状态和目的基因启动子之间的动态相互作用，从而研究组蛋白修饰与目的基因表达之间的关系研究蛋白与RNA的相互作用基于CHIP的原理发展出来的RIP（RNA-IP）技术可以用来研究目的蛋白与RNA之间的相互作用信息 在所有免疫沉淀相关实验中，抗原的起始浓度相对其它免疫相关实验（WB和IF等）要低得多，所以对抗体的亲和力相对其它实验(WB和IF等)提出了很高的要求，这就需要使用高亲和力的抗体去进行免疫沉淀相关实验。同时，由于免疫沉淀相关实验主要是在生理条件性进行，所以需要抗体识别蛋白的天然表面构象，因此选择的抗体其针

22、对的抗原决定蔟需要暴露在蛋白表面。这些因素对制备能成功应用于IP实验的抗体提出了很高的要求：a用于免疫的蛋白抗原其构象需要尽量接近目的蛋白的天然构象或者用于免疫的多肽尽量暴露在目的蛋白的表面。获得接近天然构象的蛋白抗原的途径有很多，主要有天然提取，原核表达重组蛋白以及真核表达重组蛋白三种方式。这其中，就蛋白构象角度而言，天然提取是最佳途径，但这种方法受材料来源限制和纯化方法复杂等多因素影响，一般很少采用。原核表达因为成本低廉，操作方便最为受欢迎，但其受表达环境与大部分蛋白天然存在环境差别巨大，构象失真情况严重，抗原的构象质量有严重问题。大规模瞬时真核表达是近期新兴的表达系统，具有表达环境接近天

23、然，操作方便等诸多优点，是获取具有天然构象蛋白抗原的首选工具。b亲和力要比普通的抗体应用要求高得多。多克隆抗体由于可以结合目的抗原的多个抗原决定簇，所以在亲和力方面是首选。但考虑到特异性，获得单克隆抗体群是更好的选择。具体优缺点总结如下表。多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体群（由一个免疫原产生的多个单克隆抗体混合物）抗体抗原作用信号强度极佳由抗体的亲和力决定（极佳或者极弱）极佳特异性通常很好，但有时会有非特异性相互作用极佳，但有时会有交叉反应极佳（由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群）优点亲和力高（由于抗体可以与目的蛋白的多个抗原决定蔟相互作用）特异性好，且可以无限量供应特异性

24、好，亲和力高（由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群）缺点非特异性相互作用很难去除需要筛选亲和力高的抗体；抗原表位可能会被相互作用蛋白遮蔽能够筛选得到的符合条件的单克隆并不多，所以单克隆抗体群也就不容易获得免疫沉淀效果极佳（由于亲和力高）由抗体的亲和力决定（极佳或者极弱）极佳（由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群）免疫共沉淀效果通常很好，但有时非特异性相互作用会带来假阳性由抗体的亲和力决定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮蔽决定（极佳或者极弱）极佳（由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群）染色质免疫沉淀效果通常很好，但有时非特异性相互作用

25、会带来假阳性由抗体的亲和力决定和抗原表位是否被遮蔽或者以及抗原表位是否被交联实验所破坏决定（极佳或者极弱）极佳（由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群）Troubleshooting for IP, CO-IP，RIP and CHIP免疫沉淀产生的问题产生问题的原因解决办法没有得到目的蛋白或者得到的目的蛋白太少1.目的蛋白在样品中含量太低或者检测样品中没有目的蛋白更换样品或者在细胞中过表达目的基因2.加入的proteinA/G-beads太少或者与一抗的结合属性不匹配增加proteinA/G-beads至60ul/mg总蛋白；检查proteinA/G-beads与一抗的

26、结合属性3.抗体或者proteinA/G-beads与样品作用时间太短正确按照protocol操作，抗体或者proteinA/G-beads与样品作用时间最短不能少于2小时4.蛋白发生降解尽量使用新鲜制备样品进行免疫沉淀实验；将样品至于冰上或者在冷库中操作5.杂蛋白太多加入抗体和proteinA/G-beads前100，000g离心细胞30 min以去除膜成分或者不可溶蛋白6.目的蛋白没有溶解或者溶解不充分针对目的蛋白的特性选择合适的裂解液7.抗体使用浓度太低提高抗体使用浓度8.抗体亲和力差更换亲和力更高的抗体9.抗体所识别的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽,无法与目的蛋白相互作用更换抗体10.抗

27、体选择不合适,所选择的抗体不能识别处于天然构象的蛋白更换抗体11.抗体或者proteinA/G-beads与样品作用时间太短正确按照protocol操作，抗体或者proteinA/G-beads与样品作用时间最短不能少于2小时12.洗涤条件过于剧烈减少洗涤次数；降低洗涤缓冲液中的盐浓度或者更换更温和的去垢剂13.检测灵敏度不够更换检测试剂(针对WB检测)或者提高检测水平(针对质谱检测)有非特异性相互作用或者严重的交叉反应1.Protein A/G-beads对蛋白的非特异性吸附或者样品中有其它蛋白与Protein A/G-beads有交叉反应用ProteinA/G-beads对细胞进行预处理去除非特异性吸附蛋白,然后再加入抗体；加入2%BSA于ProteinA/G-beads中对beads进行预封闭2.抗体特异性不好更换抗体或者设立阴性对照(IgG或者其它无关抗体)3.裂解液配方过于温和